光学纯氨基酸是医药、农药、人工多肽和食品添加剂等化学品制备过程中的重要中间体，有巨大的工业利用价值。利用“海因酶/氨甲酰基水解酶法”生产光学纯氨基酸包括两个基本反应步骤，DL-5-取代的海因在立体专一性的海因酶作用下水解生成N-氨甲酰基氨基酸，后者在专一性的N-氨甲酰基水解酶作用下进一步水解生成相应的光学纯氨基酸。本论文将通过对海因水解酶系统的研究揭示海因酶和氨甲酰基水解酶的生化本质和进化过程，同时对该系统的工业化应用进行了初步研究。　　 以N-氨甲酰基-D-对羟苯甘氨酸为单一氮源，从土壤中筛选到一株能水解该化合物的菌株S-5菌。基于该菌的形态特征、生理生化特性及16S rRNA序列的系统发育学分析表明，该菌属于中华根瘤菌(Sinorhizobium morelens)。通过对转化产物的旋光分析和毛细管电泳检测表明，该菌同时含有海因酶和氨甲酰基水解酶，而且两酶都是D-专一性的。该菌能利用多种碳源和有机氮源，最有利于菌体生长和产酶的碳氮源分别是甘油(最适浓度是10 g/L)和酵母膏(最适浓度是15 g/L)。海因酶和氨甲酰基水解酶都是诱导酶，主要产生于细胞对数生长后期，最适诱导物是DL-5-(3-吲哚甲基)海因。静息细胞转化试验表明：在含有30 g/L DL-5-对羟苯海因的100 mM Tris-HCl缓冲液(pH8.2，10 mL)中，转化温度为45℃，10 g/L的静息细胞能够在18 h内将DL-5-对羟苯海因转化为D-对羟苯甘氨酸，产率为95％，e.e值大于99％。　　 经过双水相萃取和MonoQ强阴离子交换色谱以及Superdex200 HR分子筛层析，从Sinorhizobium moreiens S-5菌的粗酶液中获得电泳纯D-氨甲酰基水解酶。酶纯化的收率为19.1％，纯化了189倍。酶N-端序列为Thr-Arg-Gln-Met-Ile—Leu—Ala-Val—Gly-Gin-。根据酶N-端测序结果设计简并引物，进而通过LA PCR的方法获得D-氨甲酰基水解酶基因hyuC，该基因可在大肠杆菌pET系统中获得高水平表达，活力比原始菌S.5提高27倍。重组蛋白经热处理及DEAE阴离子交换、Phenyl疏水层析和Superdex200 HR分子筛层析后被纯化，总收率为21.2％，纯化倍数为16.1。D-氨甲酰基水解酶是一个四聚体的蛋白，亚基的分子量是38 kDa。比较其它的D-氨甲酰基水解酶可知，该酶有多种亚基聚集状态，有二聚体、三聚体，但四聚体为第一次报道。该酶催化反应的最适pH为7.0，pH稳定范围为6.5-8.0；最适反应温度为60℃，该酶的热稳定性和氧化稳定性较高，在55℃保温1h，酶活力仍然保持有70％。酶催化的底物谱较广，其催化水解底物N-氨甲酰基-D-对羟苯甘氨酸的Km值为3.756 mM，最大反应速度Vmar为382 U/mg。　　 以pUC18为载体，构建了S.morelens S-5菌的基因组文库，通过对文库进行活性筛选，获得D-海因酶基因hyuH。该基因与D-氨甲酰基水解酶基因hyuC相连锁，但转录方向相反。进化分析表明D-海因酶属于酰胺水解酶超家族的成员，序列中含有保守结构域GXXDXHXH。hyuH在大肠杆菌pET载体系统中表达的产物全部是包涵体。而当把hyuH置于其自身的启动子下表达时却获得成功。与原始菌株S.morelens S-5相比，重组菌中D-海因酶的表达量提高了38倍。重组酶是一个四聚体蛋白，亚基的分子量经MALDI-TOF测定为50730 Da。酶催化反应的最适pH为8.5，pH稳定范围为7.5-10.0；最适反应温度为60℃，酶的热稳定性较高，在55℃保温30 min，酶活力仍然保持有91％。酶催化底物5-对羟苯海因、5-苯海因和5-甲硫乙海因的Km值分别为8.68 mM、24.13 mM和17.52 mM。ICP-AES的分析结果表明D-海因酶是金属酶，该酶中含有Fe2+(或Fe3+)离子，每摩尔亚基对应2.2摩尔Fe。用Mn2+替换酶分子中的Fe2+(或Fe3+)，酶的催化活性显著提高。进一步研究表明海因酶的底物谱较广，因此利用该系统可以生产多种D-型氨基酸。　　 通过批次补料发酵，在30h的发酵过程中获得25g/L的细胞干重，海因酶的最大比活为5.1×104U/g CDW。在整个发酵过程重组质粒pUCm-HyuH在E.coli DH5α中是稳定的，因此在实际的工业化生产中不需要加入抗生素。通过实验确定了E.coliDH5α(pUCm—HyuH)静息细胞转化反应的最适条件：在含有40 g/L DL-5-对羟苯海因的100 mM Tris-HCl缓冲液(pH9.0，10 mL)中，转化反应的温度为45℃；每克底物使用20 U的酶量进行转化反应，8 h时的转化率可以达到98％，产物N-氨甲酰基-D-对羟苯甘氨酸的e.e值大于99％。