【摘 要】
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目的:构建大肠杆菌-分支杆菌分泌型原核穿梭表达质粒(pBCG-SP),将结核分支杆菌热休克蛋白65KD(HSP65)的全长基因克隆入这个新型的载体,并将其导入耻垢分支杆菌和BCG中表达,构
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目的:构建大肠杆菌-分支杆菌分泌型原核穿梭表达质粒(pBCG-SP),将结核分支杆菌热休克蛋白65KD(HSP65)的全长基因克隆入这个新型的载体,并将其导入耻垢分支杆菌和BCG中表达,构建人结核杆菌HSP65重组BCG疫苗,为该室下一步的研究工作奠定基础.方法:用PCR技术从BCG基因组中扩增出抗原85B(As85B)的信号肽DNA序列,从pCMVMTHSP65质粒中扩增出HSP65全长基因.信号肽DNA序列用BamHI和NsiI分别消化,HSP65DNA序列用NsiI和KpnI分别消化.同时制备大量的表达载体pBCG-2100,用BamHI和KpnI消化.利用基因重组技术构建一个分泌型的原核穿梭表达质粒(pBCG-SP-HSP65).利用电穿孔的方法将该质粒分别转入耻垢分支杆菌和BCG中,经热诱导后,用SDS-PAGE电泳来观察其表达水平.利用western-blot来检验HSP65的生物学活性. 结论:成功构建了分泌型原核穿梭表达载体pBCG-SP,结核分支杆菌热休克蛋白65KD基因通过此载体在BCG中能高效表达,并且表达的HSP65具有生物学活性.人结核杆菌HSP65重组BCG疫苗构建成功.
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