目的构建两歧双歧杆菌介导的铜绿假单胞菌外膜蛋白F-I疫苗,研究其对小鼠的保护力及免疫机制。方法以铜绿假单胞菌PA01标准株提取的基因组DNA为模板,PCR分别扩增OprF和OprI抗原基因,通过基因拼接法剪接获取OprF-I融合基因,插入pGEX-1λT,得到pGEX-OprF-I后电穿孔至E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导,用SDS-PAGE和Western blot对重组菌的表达情况进行分析和鉴定。将重组质粒电穿孔到两歧双歧杆菌中,构建重组Bb(pGEX-OprF-I)疫苗并进行双酶切和PCR鉴定,然后分析及鉴定其诱导表达产物。将rBb(pGEX-OprF-I)疫苗灌胃接种小鼠,PA01株攻击后2周杀鼠,常规ELISA检测血清抗体,分离肺组织计数肺细菌负荷,分离脾脏制备脾细胞悬液,分别用MTT法和FCM检测脾细胞的增殖、亚群及凋亡,PCR检测脾细胞因子变化。结果成功扩增1050 bp的OprF基因、194 bp的OprI基因和1289 bp的重庆市科委地方病重大专项基金项目(No.2008AB5055,2008AB5008,2008AB5054)OprF-I融合基因,OprF-I融合基因成功插入pGEX-1λT并转化BL21(DE3),SDS-PAGE分析重组菌表达Mr约68×10~3的融合蛋白,Westen blot表明该蛋白具有抗原特异性。重组质粒pGEX-OprF-I成功转化Bb,重组Bb(pGEX-OprF-I)疫苗可表达Mr约68×10~3的融合蛋白且可被Pa感染鼠血清特异性识别。与对照组比较,疫苗组的肺细菌菌落数减少;血清IgG及其亚类水平升高;脾细胞增殖活性增强,CD4~+T细胞百分比增高,而凋亡率下降;疫苗组脾细胞可扩增出IFN-γ、IL-12、IL-4、IL-17及Foxp3基因片段。结论成功构建重组Bb(pGEX-OprF-I)疫苗,该疫苗可产生体液及细胞免疫应答,对小鼠具有抗Pa感染的保护作用。