胰腺组织是人体最主要脏器之一,内分泌部的β细胞缺失或功能发生障碍就会引起糖尿病。对胰腺发育和胰腺干细胞的研究的重要性日益凸显,成为当代最重要和最活跃的生命科学研究领域之一。其中胰腺发育研究的核心问题是细胞命运决定及细胞增殖和分化的分子机理。胰十二指肠同源盒(pancreatic and duodenal homeobox 1,Pdx1)及胰腺特异转录因子1a(pancreas specific transcription factor 1a,Ptf1a)等在胰腺祖细胞向内分泌祖细胞分化过程中扮演着关键角色。两者之间的相互关系决定着胰腺发育命运。如何在体内、外示踪以转录因子Pdx1和Ptf1a为标记的胰腺细胞的分化命运,存在一定技术难度。谱系追踪系统可以示踪来源于同一细胞的所有子代细胞,是在成体哺乳类组织中研究干细胞特性的一种重要工具。因此,利用基因谱系示踪技术建立Pdx1Dre/w;Ptf1aCre/w;Rosa26CAG-RSR-AcGFP1/CAG-LSL-Tomato杂合小鼠的双基因谱系示踪模型,为解决在胰腺发育过程中示踪标记Pdx1和Ptf1a细胞分化命运难题的可行方案。目的:本实验就是通过采用选择性基因打靶的方法,结合Cre/Dre重组酶技术,构建嵌合型Pdx1和Ptf1a双基因谱系示踪小鼠模型(Pdx1Dre/w;Ptf1aCre/w;Rosa26CAG-RSR-AcGFP1/CAG-LSL-Tomato)。采用现代先进光学设备和生物技术,实现活体细胞的谱系示踪,为探究胰腺正常发育、疾病发生及损伤修复过程中细胞的来源问题提供更加直观有力的研究方法和科学的研究手段。方法:主要是从双基因谱系示踪小鼠模型构建、鉴定,胰腺发育过程细胞分化示踪观察,以及胰腺部分切除后标记细胞分化表达变化等三方面进行研究。一、Pdx1及Ptf1a双基因谱系示踪小鼠模型的建立和鉴定主要包括:(1)繁殖和筛选Pdx1-DrePtf-1a-Cre Knock in小鼠以及Dre及Cre报告系统小鼠Rosa26CAG-RSR-AcGFP1、CAG-LSL-Tomato。(2)通过定时交配的方法,在其子代小鼠中获得Pdx1Dre/w;Ptf1aCre/w;Rosa26CAG-RSR-AcGFP1/CAG-LSL-Tomato细胞示踪模型。(3)基因型鉴定:提取小鼠的基因组DNA进行PCR扩增,再对产物进行凝胶电泳分离,判断有无预期大小的扩增产物,从而鉴定小鼠的基因型。(4)Wester-Blot检测Pdx1、Ptf1a蛋白在胰腺中的表达。(5)观察转基因模型小鼠的体重变化、空腹血糖及糖耐量变化曲线。二、胰腺发育过程中Pdx1+及Ptf1a+细胞分化示踪表达主要包括:(1)转基因小鼠胰腺标本的获取及准备。(2)激光共聚焦显微镜观察GFP及Tomato定位。(3)实时动态监测Pdx1+及Ptf1a+细胞在胰腺发育中的变化。(4)实验小鼠胰岛的分离及纯化。(5)流式细胞术检测Pdx1+及Ptf1a+细胞在胰岛及胰管中的表达。(6)免疫荧光染色观察Ki67以及Caspase3表达。三、胰腺部分切除后Pdx1+及Ptf1a+细胞分化表达变化主要包括:(1)小鼠胰腺部分切除手术。(2)小鼠胰腺部分切除后血糖及糖耐量的测定。(3)观察Pdx1+及Ptf1a+细胞在胰腺手术后的表达。(4)免疫荧光染色观察β细胞变化。结果:一、成功构建小鼠Pdx1+及Ptf1a+细胞分化谱系示踪模型(1)在荧光显微镜下观察,我们可以发现基因型为Ptf1a-Cre/w;Pdx1-Dre/w;CAG-AcGFP/Tom的胰腺组织可以表现为,GFP+Tomato+双荧光阳性。Ptf1a-Cre/w;CAG-AcGFP/Tom基因型的小鼠胰腺组织仅为Tomato+,Pdx1-Dre/w;CAG-AcGFP/Tom基因型的小鼠胰腺组织表现为GFP+。(2)本实验所培育的转基因实验小鼠无论在重量、血糖还是糖耐量方面,与正常对照小鼠之间不存在差异性。二、Pdx1+细胞是胚胎期胰腺前体细胞,Pdx1+Ptf1a-细胞最终只在胰岛中表达(1)本实验示踪的Pdx1+和Ptf1a+细胞在整个胰腺发育过程中随着时间的变化,其表达位置也发生变化。表现为Pdx1+Ptf1a+细胞逐渐增多,随着胰腺发育,几乎所有的腺泡细胞被该细胞取代。(2)Pdx1+Ptf1a-细胞在胚胎期的飙到最多,随着胚胎发育,Pdx1+Ptf1a-细胞数量逐渐减少,并最终表达于胰岛及胰管细胞。而Pdx1-Ptf1a-细胞在整个胰腺发育过程中几乎没有发现。(3)对培养的小鼠胰腺胚胎组织E15.5细胞团进行连续动态观察,可以清晰看到胰腺细胞团的组成中,存在单独绿色荧光细胞,而绝大部分组成细胞为GFP+/Tomato+细胞。并在连续动态观察中,发现单独绿色荧光细胞逐渐被GFP+/Tomato+细胞替代。(4)在成功分离胰岛和胰管细胞的基础上,流式分选技术发现了在胰岛细胞中,绝大部分为Pdx+Ptf1a+双阳性细胞,其次为Pdx+Ptf1a-细胞,Ptf1a+Pdx-细胞近乎没有。而在胰管细胞中,Pdx+Ptf1a+双阳性细胞仍占多数,其次为Ptf1a+Pdx-细胞,最少的为Pdx+Ptf1a-细胞。三、Ki67表达随着胰腺发育逐渐降低从本实验的荧光染色结果来看,在胚胎期胰腺组织中,统计Pdx+Ptf1a+的谱系细胞,我们发现在胚胎发育期Ki67在Pdx+Ptf1a+的细胞中的表达最多,Ki67阳性率在出生后呈梯度下降。Ki67在Pdx+Ptf1a-的细胞中的表达,在胚胎期E15.5时阳性表达最高,随着发育逐渐降低。但是Ki67在Pdx+Ptf1a-的细胞中表达率无论在胰腺发育的哪个时期都比在Pdx+Ptf1a+细胞中的表达要低。相对于Ki67,Caspase3的表达率非常低。四、胰腺部分切除后出现高血糖应激反应,刺激Pdx1+Ptf1a-细胞的增生(1)手术组产生短期的高血糖环境。IPGTT数据显示,在术前小鼠静脉注射葡萄糖后血糖明显升高,但每组小鼠均能在短时间内恢复到接近正常相对稳定的水平。然而,小鼠术后对葡萄糖耐受能力发生了改变。(2)结果显示,胰腺部分切除组胰岛β细胞的表达有所增加。(3)同时,我们也发现了在术后的胰岛中Pdx1+Ptf1a-细胞的比例也明显增加。结论:(1)本次实验成功构建了小鼠Pdx1和Ptf1a双基因谱系示踪模型,将为探究胰腺正常发育、疾病发生及损伤修复过程中细胞的来源问题提供更加直观有力的研究方法和科学的研究手段。有望开启胰腺发育生物学及糖尿病基因治疗机制研究的新篇章。(2)Pdx1+细胞为小鼠胚胎胰腺发育的祖细胞,Ptf1a+细胞在Pdx1+细胞基础上分化而来。随着胰腺组织的发育,几乎所有的胰腺细胞包括胰岛、胰管、腺泡等细胞均来源于Pdx1阳性细胞的转化。不同细胞的增殖率可能是导致细胞比例发生变化的原因。(3)出生后胰腺Pdx1+Ptf1a-的表达逐渐下降,最后主要集中在胰岛及胰管细胞,成为β细胞再生的源动力。在胰腺部分切除后,出现高血糖应激反应,从而发生β细胞再生现象,这一点或许与Pdx1+Ptf1a-细胞的增生有关。