肿瘤是目前对人类生命威胁最大的疾病之一,研究肿瘤发病原因,寻找预防和治疗肿瘤的特异性药物和方法,是很多医学科研工作者关注的重点领域。由于肿瘤细胞具有永生性的特点,而肿瘤细胞的异常增殖和分化和细胞凋亡的异常均可以引起肿瘤的发生。在多细胞生物体内,细胞凋亡具有清除多余及有潜在危险的细胞,保证机体内细胞的平衡的作用,从而保证细胞处于自稳状态;如果打破细胞凋亡的调节机制,则机体就会产生疾病,甚至肿瘤的发生,因此,细胞中正常的凋亡过程被抑制与肿瘤的形成和发展有紧密的联系。而阐明对细胞凋亡调控的分子信号通路及其调控机制,寻找并利用可以拮抗凋亡抑制因子的因子,诱导肿瘤细胞的凋亡,成为肿瘤临床治疗研究的最终目标。与正常细胞生长过程一样,在肿瘤形成和转移过程中,常伴有活跃的能量代谢的过程,在此过程中,过氧化物酶体增殖物活化受体γ协同刺激因子1（PGC-1）起着非常关键的作用。PGC-1基因家族主要包括PGC-1α、PGC-1β和PRC,三者在基因组成和蛋白结构上具有一定的相似性,它们之间也存在相互作用。其中,PGC-1β与脂肪形成和代谢、运动肌肉损伤修复及血管增殖、细胞凋亡过程均有相关性。在调控细胞增殖过程的众多信号通路中,哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信号通路因能够整合细胞外多种信号刺激,影响机体细胞活动的各个方面,在细胞信号调控研究中具有重要作用。已有文献报道,PGC-1β在肿瘤细胞凋亡过程中起调控作用,而mTOR信号通路参与了这个调控过程的调节,但二者之间具体的调控关系和分子机制尚不清楚,且目前未见有任何相关研究的文献报道;因此,阐明mTOR信号通路调控PGC-1β介导的细胞凋亡的分子机制,以及二者之间的调控关系成为我们研究的重点。乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤,严重威胁女性健康。已有研究证实,乳腺肿瘤发病的主要原因是因为肿瘤组织内存在乳腺肿瘤干细胞（Breast Cancer Stem Cells,BCSCs）,研究腺乳腺肿瘤干细胞凋亡的调控机制,进而针对性的设计方法抑制乳腺肿瘤组织的生长,是乳腺肿瘤治疗的一个途径。本研究中,我们选择乳腺肿瘤干细胞作为研究对象,以PGC-1β与mTOR信号通路对其细胞凋亡的调控机制作为研究目标。首先通过分离培养鉴定BCSCs,并构建PGC-1β干扰和过表达载体。然后将构建好的载体转染至BCSCs中,并检测相关指标的改变情况;具体实验方法主要有:1)乳腺肿瘤干细胞的分离及鉴定:收集临床术后乳腺肿瘤组织,经机械剪切联合酶消化法获得肿瘤细胞并培养,流式细胞仪鉴定细胞表面抗原,MTT比色法检测细胞生长曲线,实时荧光定量PCR（qPCR）鉴定细胞Sox2、Nanog等基因表达,免疫荧光检测细胞特异性蛋白Bcl-2、PR、VEGF、Ki-67等的表达,以及裸鼠致瘤性实验等。结果证明,成功获得了乳腺肿瘤干细胞,该细胞在体外培养过程中保持克隆球样形态生长,鉴定结果发现其具有CD44+/CD24-表型,高表达Sox2、Nanog基因,且Bcl-2、PR、VEGF、Ki-67等蛋白均阳性表达,且该细胞具有较强的裸鼠致瘤性,所产生的二次肿瘤符合乳腺肿瘤组织的病理学特征。通过本实验,我们成功获得了人乳腺肿瘤干细胞,为后续研究肿瘤增殖及凋亡等提供了实验材料。乳腺肿瘤干细胞的成功分离,为进一步开展乳腺肿瘤发生、侵袭、耐药及复发机制的研究提供基础,同时也为研究针对乳腺肿瘤干细胞的个性化靶向治疗及疗效评价提供实验模型。2)PGC-1β过表达和干扰载体的构建:检测正常乳腺组织和乳腺肿瘤组织细胞中PGC-1β的表达,发现PGC-1β在乳腺肿瘤组织细胞中的表达明显高于正常乳腺组织,为进一步研究其功能,我们分别构建了 PGC-1β的真核表达载体pcDNA3.1/PGC-1β和干扰载体pGenesil/shPGC-1β,用于下游PGC-1β功能的研究。PGC-1β干扰和过表达载体的构建成功,为后续深入研究PGC-1β在肿瘤干细胞增殖和凋亡过程中的作用机制奠定基础。3)转染PGC-1β过表达和干扰载体后人乳腺肿瘤干细胞凋亡检测:哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信号通路具有调控细胞增殖功能,并参与了 PGC-1β调控肿瘤细胞凋亡的过程,但具体调控机制并不清楚,且未见文献报道。为此,我们设计了本实验,通过检测PGC-1β对线粒体基因组表达的调节作用,明确其对线粒体生物合成的影响;继而检测过表达和干扰抑制PGC-1β后细胞的改变,评估其对细胞AMPK信号通路的影响;mTOR信号通路相关蛋白改变与PGC-1β表达的关系;最后检测了 PGC-1β表达改变对细胞凋亡的影响。结果证明,过表达PGC-1β能够增强线粒体生物合成,引起AMP与ATP间比值的改变,并增加AMPK的活化程度;还可增强mTORC1蛋白磷酸化,降低mTORC2蛋白磷酸化,进而引起细胞凋亡率降低,而干扰降低PGC-1β表达后则会导致相反的结果。由此证明,PGC-1p在调控乳腺肿瘤干细胞凋亡的过程中起正调控作用,这种正调控作用是在mTOR信号通路的协同作用下共同实现的。结论:本研究首先从乳腺肿瘤组织中成功分离培养获得了乳腺肿瘤干细胞,鉴定结果证明该细胞具有肿瘤干细胞的特性;然后成功构建了 PGC-1β过表达和干扰表达载体,并将载体转染乳腺肿瘤干细胞后检测细胞代谢基因和mTOR信号通路相关蛋白表达的改变情况,研究结果表明,PGC-1β可以促进mTORC1蛋白磷酸化及降低mTORC2蛋白磷酸化,进而影响细胞凋亡比率,说明PGC-1β在mTOR信号通路的协同作用下对乳腺肿瘤干细胞凋亡起正调控作用。