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动脉炎病毒科和冠状病毒科同属套式病毒目。这两个科的病毒均编码一种3C样蛋白酶(3C-Like protease,3CLpro),也称主蛋白酶,负责将病毒编码的多聚蛋白前体切割成成熟的非结构蛋白,在病毒的复制进程中发挥关键作用。同时,该蛋白酶还能利用其切割活性切割宿主蛋白,尤其是IFN产生和信号转导的关键分子,发挥免疫调节作用。以前的研究表明,动脉炎病毒和冠状病毒的3C样蛋白酶均可切割I型干扰素产生通路中的关键蛋白激酶NEMO（NF-κB essential modulator）,但不同的动脉炎病毒或冠状病毒切割NEMO的位点存在一定差异。为了系统了解不同的动脉炎病毒和冠状病毒识别和切割NEMO的差异及其作用机制,本研究以动脉炎病毒和冠状病毒3CLpro切割NEMO为切入点,选择严重危害动物或者人类健康的猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、马动脉炎病毒（EAV）、SARS冠状病毒（SARS-CoV、SARS-CoV-2）、鼠冠状病毒（MHV）为研究对象,探讨它们编码的3CLpro调控IFN产生的分子机制。具体内容如下:1.动脉炎病毒PRRSV和EAV nsp4切割NEMO的多个位点抑制干扰素产生NF-κB必需调节蛋白（NEMO）是干扰素信号通路的关键分子,前期文献报道PRRSV非结构蛋白nsp4(编码3CLpro)能通过切割NEMO的第349位谷氨酰胺（E349）抑制IFN-β产生。但是,本研究通过双荧光素酶实验发现其切割后片段NEMO（1-349）仍具有诱导IFN-β产生的能力,并且PRRSV nsp4能进一步抑制NEMO（1-349）激活IFN-β,提示E349位的切割并没有使NEMO丧失诱导IFN-β的能力,可能还存在其它的切割位点。Western blot实验进一步证实PRRSV nsp4和EAV nsp4均能切割NEMO的多个位点,而且PRRSV和EAV感染细胞均能导致内源性NEMO表达降低。通过构建NEMO的一系列突变体,证实PRRSV nsp4和EAV nsp4均可切割NEMO的E166、E171、E349位点;同时,EAV nsp4还可以切割一个额外的位点Q205。如预期一样,除NEMO（1-349）外,其它切割后片段均丧失诱导IFN-β产生的能力。进一步的结构模拟分析发现,PRRSV nsp4和EAV nsp4的底物识别口袋S1位存在差异,推测S1口袋可能是导致识别差异的关键。上述研究结果表明,动脉炎病毒PRRSV和EAV的nsp4均需要切割NEMO的多个位点以拮抗IFN-β产生。2.冠状病毒SARS-CoV-2 nsp5和SARS-CoV nsp5切割NEMO的能力不同前期研究发现α-冠状病毒PEDV nsp5(编码3CLpro)和δ-冠状病毒PDCoV nsp5能切割NEMO的单个位点Q231,然而关于β属冠状病毒是否切割NEMO尚不清楚。本研究发现SARS-CoV-2 nsp5和SARS-CoV nsp5能切割NEMO的三个位点（E152、Q205、Q231）。值得关注的是,SARS-CoV-2 nsp5切割NEMO的能力强于SARS-CoV nsp5。通过序列比对和结构比较发现,在nsp5的S2底物识别口袋附近区域（第44-50位氨基酸）,存在一个氨基酸的差异。其中,SARS-CoV-2 nsp5的第46位氨基酸为丝氨酸（S）,而SARS-CoV nsp5对应的氨基酸为丙氨酸（A）,该位点的差异可能导致了二者切割NEMO效率的不同。进一步采用点突变和体外酶活实验,证实SARS-CoV-2 nsp5 S46A突变体切割NEMO的能力明显变弱,SARS-CoV nsp5 A46S突变体切割NEMO的能力明显增强,表明第46位氨基酸对nsp5的切割强度起至关重要的作用。由于SARS-CoV-2 nsp5切割NEMO的能力强于SARS-CoV nsp5,推测SARS-CoV-2 nsp5拮抗干扰素的能力强于SARS-CoV nsp5。双荧光结果证实了此猜测,且发现这种差异是由于第46位氨基酸的不同所致。此外,进一步的研究表明多种冠状病毒的蛋白酶均可以靶向NEMO的不同位点,且属于β属lineage A分支的另外两种病毒蛋白酶靶向NEMO时呈现了与SARS-CoV-2 nsp5不同的切割情况。3.冠状病毒MHV nsp5通过切割NEMO和MDA5而抑制IFN-β的产生进一步分析了与SARS冠状病毒同属β-冠状病毒但属于不同分支的MHV（属于β-冠状病毒属lineage A）切割NEMO的情况,意外发现MHV nsp5能切割NEMO的5个位点（Q145、E152、Q180、Q205、Q231）,且依赖于其自身蛋白酶活性,提示MHV nsp5的识别口袋具有更大的包容性,能识别和切割更多不同底物,结构分析也证实了这一推测。值得注意的是,除了切割NEMO外,MHV nsp5还能切割干扰素信号通路的模式识别受体MDA5,其切割位点为MDA5的Q818,被切割的MDA5片段MDA5（1-818）和MDA5（818-1025）均丧失诱导IFN-β产生的能力。上述结果表明,MHV nsp5切割NEMO的模式更加复杂,而且可以切割干扰素信号通路中的其它分子,发挥协同拮抗IFN产生的作用。总之,本研究系统阐述了动脉炎病毒（PRRSV、EAV）和冠状病毒（SARS-CoV、SARS-CoV-2、MHV）3C样蛋白酶切割NEMO的差异及其与天然免疫信号通路的关系,揭示了不同病毒3C样蛋白酶识别宿主蛋白的分子基础,为阐明病毒进化、致病机制和药物开发提供了新的线索。