论文部分内容阅读
模式识别受体(pattern recognition receptors, PRRs)通过识别内源性的危险相关分子模式(damage associated molecular pattern, DAMPs)和检测病原体相关分子模式(pathogen associated molecular patterns, PAMPs)启动天然免疫。NOD样受体(NOD-like receptors，NLRs)是一类位于细胞质的重要的模式识别受体,其家族成员NLRP3(nucleotide-binding domain and leucine-rich repeat-containing protein 3)激活后发生寡聚化并招募下游的接头蛋白ASC(apoptosis-associated speck-like protein containing a caspase recruit domain )和capsase-1(cysteine-aspartic acid protease 1)前体蛋白组装成NLRP3炎症小体，最终导致caspase-1的激活以及诱导非经典分泌途径。NLRP3炎症小体可以被多种PAMP和DAMP激活，包括尼日利亚菌素(Nigericin)、ATP、颗粒分子和晶体，其分子机制均为激活细胞内钾离子外流。
但是，钾离子是否参与并调控NLRP3炎症小体组装的初始步骤-NLRP3蛋白自我组装过程仍然未知。
蛋白质的液-液相分离(liquid-liquid phase separation，LLPS)是无膜细胞器(Membrane-less organelles, MLOs)形成的基础，对维持正常细胞功能至关重要。本论文拟解决的关键科学问题是：钾离子的浓度改变是否能够影响NLRP3蛋白的寡聚化？钾离子调节的NLRP3寡聚化是否为蛋白质的液-液相分离过程？
结合生物信息学、细胞模型以及蛋白质原核表达等方法，主要研究如下：
(1)胞内钾离子外流诱导NLRP3蛋白自我组装。首先，使用10mMNigericin处理50ng/mlPMA诱导分化的THP-1细胞45min使细胞内钾离子浓度降低。用酶联免疫吸附和免疫荧光实验分别检测培养基中的IL-1β和细胞中NLRP3蛋白，发现Nigericin引起的细胞内钾离子外流可以诱导内源性NLRP3炎症小体激活；然后，通过在线转录组数据库分析，确定HEK-293不表达包括NLRP3内的所有炎症小体相关的元件。10mMNigericin处理瞬时转染CFP-C1NLRP3蛋白的HEK-293细胞45min，发现钾离子外流可以诱导NLRP3蛋白自我组装。
(2)HEK293细胞中异源表达的NLRP3蛋白的自我组装是蛋白质液-液相分离(Liquid-liquid phase separation，LLPS)过程。通过网站(plaac.wi.mit.edu)
确定了NLRP3蛋白第407-421位氨基酸位点为富含谷氨酰胺和天冬酰胺内部无序区(intrinsically disordered regions，IDRs)；10mMNigericin处理瞬时转染mCherry-C1NLRP3的HEK-293细胞45min后，荧光漂白恢复(Fluorescence Recover After Bleach，FRAP)实验结果表明，NLRP3蛋白的自我组装是LLPS的过程。
(3)生物化学水平上，钾离子可以相对抑制NLRP3蛋白的寡聚化。用150mMNaCl或KCl缓冲液裂解瞬时表达NLRP3的HEK-293细胞，以及使用Native-PAGE和辛二酸琥酰亚胺(DSS)交联的SDS-PAGE检测NLRP3蛋白的寡聚化水平，确定了使用钾离子缓冲液纯化NLRP3蛋白；最后使用C43(DE 3)大肠杆菌表达和纯化了含MBP标签的NLRP3蛋白(MBP-NLRP3 )并将MBP-NLRP3蛋白稀释到含150mM谷氨酸钾和和谷氨酸钠缓冲液中检测缓冲液的OD600值，发现钾离子同样可以相对地抑制NLRP3蛋白的寡聚化。
(4)人类冷吡啉相关周期性综合征(Cryopyrin-Associated Autoinflammatory Syndromes，CAPS)相关的NLRP3突变体不仅对钾离子外流敏感，还对冷刺激敏感。首先，结合疾病数据库(infevers.umai-montpellier.fr)构建了NLRP3T405P、M406V、M406I、L411V以及W414L突变体(均位于NLRP3第407-421位氨基酸)，瞬时转染HEK-293细胞，发现NLRP3T405P、M406V和W414L突变体异常自我组装较为明显以及HEK-293突变体(mCherry-C1 NLRP3 T405P)复合物在细胞质具有动态性质，表现为不断地融合与分离；然后，HEK-293细胞共转染NLRP3野生性和突变型蛋白发现突变体可以异源寡聚化；最后，用10mMNigericin分别处理mCherry-C1NLRP3野生型和突变体，发现野生型和突变体均可响应细胞内钾离子外流，且突变体动态特征发生改变，主要表现在蛋白聚集时间显著延长。此外，通过对突变体的低温刺激，发现突变体寡聚物性质发生改变，主要表现为荧光漂白后，荧光恢复时间大大延长甚至无法恢复。
综上所述，本论文发现钾离子浓度可以直接调节NLRP3蛋白的寡聚化，可能对NLRP3炎症小体组装的起始阶段起到关键作用。进一步也明确了钾离子浓度降低诱导的NLRP3蛋白寡聚化是一个液液相分离过程且人类疾病相关的突变对钾离子浓度敏感性的改变。NLRP3作为重要的模式识别受体，参与天然免疫、衰老及增龄相关疾病(如阿尔茨海默症和帕金森病)，解释钾离子对其激活的关键作用，有利于未来设计相关疾病的预防及治疗方法。
但是，钾离子是否参与并调控NLRP3炎症小体组装的初始步骤-NLRP3蛋白自我组装过程仍然未知。
蛋白质的液-液相分离(liquid-liquid phase separation，LLPS)是无膜细胞器(Membrane-less organelles, MLOs)形成的基础，对维持正常细胞功能至关重要。本论文拟解决的关键科学问题是：钾离子的浓度改变是否能够影响NLRP3蛋白的寡聚化？钾离子调节的NLRP3寡聚化是否为蛋白质的液-液相分离过程？
结合生物信息学、细胞模型以及蛋白质原核表达等方法，主要研究如下：
(1)胞内钾离子外流诱导NLRP3蛋白自我组装。首先，使用10mMNigericin处理50ng/mlPMA诱导分化的THP-1细胞45min使细胞内钾离子浓度降低。用酶联免疫吸附和免疫荧光实验分别检测培养基中的IL-1β和细胞中NLRP3蛋白，发现Nigericin引起的细胞内钾离子外流可以诱导内源性NLRP3炎症小体激活；然后，通过在线转录组数据库分析，确定HEK-293不表达包括NLRP3内的所有炎症小体相关的元件。10mMNigericin处理瞬时转染CFP-C1NLRP3蛋白的HEK-293细胞45min，发现钾离子外流可以诱导NLRP3蛋白自我组装。
(2)HEK293细胞中异源表达的NLRP3蛋白的自我组装是蛋白质液-液相分离(Liquid-liquid phase separation，LLPS)过程。通过网站(plaac.wi.mit.edu)
确定了NLRP3蛋白第407-421位氨基酸位点为富含谷氨酰胺和天冬酰胺内部无序区(intrinsically disordered regions，IDRs)；10mMNigericin处理瞬时转染mCherry-C1NLRP3的HEK-293细胞45min后，荧光漂白恢复(Fluorescence Recover After Bleach，FRAP)实验结果表明，NLRP3蛋白的自我组装是LLPS的过程。
(3)生物化学水平上，钾离子可以相对抑制NLRP3蛋白的寡聚化。用150mMNaCl或KCl缓冲液裂解瞬时表达NLRP3的HEK-293细胞，以及使用Native-PAGE和辛二酸琥酰亚胺(DSS)交联的SDS-PAGE检测NLRP3蛋白的寡聚化水平，确定了使用钾离子缓冲液纯化NLRP3蛋白；最后使用C43(DE 3)大肠杆菌表达和纯化了含MBP标签的NLRP3蛋白(MBP-NLRP3 )并将MBP-NLRP3蛋白稀释到含150mM谷氨酸钾和和谷氨酸钠缓冲液中检测缓冲液的OD600值，发现钾离子同样可以相对地抑制NLRP3蛋白的寡聚化。
(4)人类冷吡啉相关周期性综合征(Cryopyrin-Associated Autoinflammatory Syndromes，CAPS)相关的NLRP3突变体不仅对钾离子外流敏感，还对冷刺激敏感。首先，结合疾病数据库(infevers.umai-montpellier.fr)构建了NLRP3T405P、M406V、M406I、L411V以及W414L突变体(均位于NLRP3第407-421位氨基酸)，瞬时转染HEK-293细胞，发现NLRP3T405P、M406V和W414L突变体异常自我组装较为明显以及HEK-293突变体(mCherry-C1 NLRP3 T405P)复合物在细胞质具有动态性质，表现为不断地融合与分离；然后，HEK-293细胞共转染NLRP3野生性和突变型蛋白发现突变体可以异源寡聚化；最后，用10mMNigericin分别处理mCherry-C1NLRP3野生型和突变体，发现野生型和突变体均可响应细胞内钾离子外流，且突变体动态特征发生改变，主要表现在蛋白聚集时间显著延长。此外，通过对突变体的低温刺激，发现突变体寡聚物性质发生改变，主要表现为荧光漂白后，荧光恢复时间大大延长甚至无法恢复。
综上所述，本论文发现钾离子浓度可以直接调节NLRP3蛋白的寡聚化，可能对NLRP3炎症小体组装的起始阶段起到关键作用。进一步也明确了钾离子浓度降低诱导的NLRP3蛋白寡聚化是一个液液相分离过程且人类疾病相关的突变对钾离子浓度敏感性的改变。NLRP3作为重要的模式识别受体，参与天然免疫、衰老及增龄相关疾病(如阿尔茨海默症和帕金森病)，解释钾离子对其激活的关键作用，有利于未来设计相关疾病的预防及治疗方法。