论文部分内容阅读
研究背景:糖尿病作为一种全球性的慢性流行病,对人类的健康水平和生活质量影响极大。糖尿病病人除了高血糖这一明显指征外,还会出现众多的并发症,也正是这些并发症很大程度上危及着患者的生命。其中,糖尿病神经病理痛（DNP）是糖尿病最常见并且难以治愈的一种并发症,患者常出现痛觉过敏、自发痛及触诱发痛等临床症状。目前,有关糖尿病神经病理痛（DNP）的发生、发展机制尚不确切。以往通常将神经元作为治疗疼痛的靶标,但越来越多的研究指出:参与慢性疼痛病理变化的不单单是神经元细胞,胶质细胞在该过程中也具有重要作用。外界的伤害性刺激可引起初级感觉神经节神经末梢释放大量的三磷酸腺苷（ATP）,ATP作为神经递质能够作用于嘌呤2（P2）受体,P2受体包含P2X和P2Y受体,P2X和P2Y受体相关亚型参与神经病理痛病理过程。研究指出,伤害性刺激能够使得初级感觉神经节卫星胶质细胞对ATP的敏感性增强,且大鼠背根神经节卫星胶质细胞存在P2Y12嘌呤受体的表达。目的:本研究通过建立II型糖尿病大鼠模型及高糖高脂原代卫星胶质细胞（来源于大鼠背根神经节）模型,旨在探究背根神经节卫星胶质细胞P2Y12嘌呤受体在II型糖尿病神经病理性疼痛中的作用及其机制。方法:1、动物实验。本研究应用II型糖尿病大鼠模型,探究糖尿病神经病理痛（DNP）的相关机制。实验共分为四个组:对照组（Ctrl）、II型糖尿病模型组（DM）、模型合并P2Y12短发夹RNA（short hairpin RNA,sh RNA）处理组(DM+P2Y12sh RNA)及模型合并空载质粒处理组（即模型合并阴性对照处理组:DM+Negative Control,简称DM+NC）。实验内容:（1）血糖测定;（2）行为学测定（分别测定各组大鼠的机械缩足反射阈值和热缩足反射潜伏期）;（3）Real-time PCR方法检测各组大鼠背根神经节（DRG）中P2Y12受体、缝隙连接蛋白Cx43及炎性因子白介素1β（IL-1β）的m RNA表达水平;（4）蛋白印迹方法检测各组大鼠背根神经节（DRG）中P2Y12受体、胶质纤维酸性蛋白（GFAP）和肿瘤坏死因子I型受体（TNFR1）蛋白表达水平;（5）免疫荧光双标法检测各组实验大鼠背根神经节P2Y12受体与卫星胶质细胞标记物谷氨酰氨合成酶（GS）的表达变化。2、细胞实验。本研究通过高糖高脂处理原代培养的背根神经节卫星胶质细胞（SGCs）,建立其高糖高脂细胞模型,探寻背根神经节（DRG）卫星胶质细胞P2Y12受体在糖尿病神经病理痛中的作用及机制。细胞实验共有两个部分:一个部分的分组为对照组（Ctrl）、高糖高脂模型组（HGHF）、模型合并P2Y12sh RNA处理组(HGHF+P2Y12sh RNA)及模型合并空载质粒处理组（即模型合并阴性对照处理组:HGHF+Negative Control,简称HGHF+NC）;另一部分分组为:对照组（Ctrl）、高糖高脂模型组（HGHF）及模型合并P2Y12受体拮抗剂组(HGHF+P2Y12antagonist)。实验内容:（1）Real-time PCR方法检测各组背根神经节卫星胶质细胞（SGCs）中P2Y12受体、IL-1β的m RNA表达水平;（2）蛋白印迹方法检测各组卫星胶质细胞（SGCs）中P2Y12受体及磷酸化P38（p-P38）蛋白表达水平;（3）酶联免疫吸附测定（enzyme linked immunosorbent assay,Elisa）方法检测各组卫星胶质细胞（SGCs）培养上清液中肿瘤坏死因子α（TNF-α）的释放量;（4）荧光素-荧光素酶方法检测各组卫星胶质细胞（SGCs）ATP的释放量。结果:1、动物实验。（1）正常饮食大鼠餐后血糖水平组间无差异,DM组高糖高脂饮食四周后,餐后血糖水平仍与Ctrl组无明显差异。直至小剂量STZ注射后的第七周末,DM组大鼠餐后血糖水平明显高于Ctrl组（p<0.001）,且已达到糖尿病大鼠成模的餐后血糖指标。P2Y12sh RNA处理十天后,DM+P2Y12sh RNA组大鼠餐后血糖明显低于DM组大鼠（p<0.001）,DM+NC组大鼠的空腹及餐后血糖均明显高于Ctrl组（p<0.001）。（2）行为学结果显示,成模后的DM组大鼠的机械缩足反射阈值和热缩足反射潜伏期均明显低于Ctrl组（p<0.001）,P2Y12sh RNA处理十天后,DM+P2Y12sh RNA组大鼠行为学敏感性较DM组明显降低（p<0.001）,DM+NC组大鼠行为学敏感性与DM组无明显差异（p>0.05）。（3）DM组大鼠背根神经节P2Y12受体、缝隙连接蛋白Cx43及IL-1β的m RNA表达水平均明显高于Ctrl组（分别为p<0.001,p<0.01,p<0.001）,P2Y12sh RNA处理十天后,DM+P2Y12sh RNA组大鼠背根神经节P2Y12受体、IL-1β的m RNA表达水平较DM组明显降低（p<0.001）,Cx43 m RNA表达水平也同样低于DM组（p<0.05）,DM+NC组与DM比较无明显差异（p>0.05）。（4）DM组大鼠背根神经节P2Y12受体、GFAP及TNFR1蛋白表达水平均显著高于Ctrl组（p<0.001）,P2Y12sh RNA处理后,P2Y12受体、GFAP及TNFR1蛋白表达水平均明显下降（p<0.001）,DM+NC组与DM组比较无明显差异（p>0.05）。（5）免疫荧光双标结果表明背根神经节P2Y12受体与卫星胶质细胞标志物谷氨酰氨合成酶（GS）共表达,DM与DM+NC组大鼠P2Y12受体和GS的共表达明显高于Ctrl组,DM+P2Y12sh RNA组P2Y12受体和GS的共表达明显低于DM组。2、细胞实验。（1）高糖高脂模型组卫星胶质细胞P2Y12受体、IL-1β的m RNA表达水平均明显高于Ctrl组（p<0.001）,HGHF+P2Y12sh RNA及HGHF+P2Y12拮抗剂组P2Y12受体和IL-1β的m RNA表达水平均明显低于高糖高脂细胞模型组（p<0.001）,HGHF+NC组与高糖高脂细胞模型组比较其P2Y12受体m RNA表达水平无明显差异（p>0.05）。（2）高糖高脂细胞模型组P2Y12受体、p-P38蛋白表达水平均显著高于Ctrl组（p<0.001）,HGHF+P2Y12拮抗剂组P2Y12受体和p-P38蛋白表达水平较高糖高脂细胞模型组均明显降低（p<0.001）。（3）高糖高脂细胞模型组培养上清液中TNF-α含量明显高于Ctrl组（p<0.001）,使用拮抗剂处理后的TNF-α含量明显下降（p<0.001）。（4）高糖高脂处理后,SGCs的ATP释放量较正常组明显上升（p<0.001）,高糖高脂模型组细胞在分别使用P2Y12sh RNA及P2Y12拮抗剂处理后,其ATP释放量出现明显下降（分别为p<0.001、p<0.01）,HGHF+NC组与高糖高脂细胞模型组的ATP释放量无明显差异（p>0.05）。结论:背根神经节卫星胶质细胞P2Y12受体参与II型糖尿病模型大鼠神经病理痛的病理变化过程,且p38MAPK信号通路的激活可能涉及背根神经节卫星胶质细胞P2Y12受体介导的糖尿病神经病理痛,P2Y12sh RNA或P2Y12拮抗剂可减轻II型糖尿病模型大鼠的神经病理痛行为。