志贺菌属(shigella)细菌通称痢疾杆菌,是一类具有高度传染性和危害严重的革兰氏阴性肠道致病菌,能够通过侵袭肠上皮细胞引起患者典型的菌痢症状(发热、腹痛、腹泻)。志贺菌分4群37种血清型,在我国主要的流行菌群为福氏(86%),福氏志贺菌最主要的血清型为2a(80%)。临床感染痢疾杆菌可以导致痢疾,其症状以发热、脱水和便血为特征。痢疾是世界上,尤其是发展中国家重要的传染病之一。据世界卫生组织公告报道,全球每年菌痢患者达1.647亿,有1.632亿分布于发展中国家,并导致150万人死亡。在我国,菌痢发病率也很高,其中福氏2a型占到50-70%。目前治疗痢疾的主要方式是抗生素,但高达95%的临床分离株对多种抗生素产生了耐药性;最佳治疗手段是疫苗,但对其致病机理和宿主的免疫保护机制还不很清楚。菌痢严重危害我国人们的健康,对痢疾杆菌进行研究具有重要的意义。因此,福氏2a志贺氏菌的基础研究对于我国卫生防疫工作尤为重要。在原核生物基因组中除了tRNA、rRNA和mRNA这三种我们很熟悉的RNA以外,目前已经知道还含有许多编码非常规调控的RNA。这些RNAs的长度为50-400nt,通常由原核生物的基因间区编码但是并不翻译成蛋白质,因此被称为非编码小RNA,简称小RNA(sRNA)或非编码RNA(ncRNA)。近年来,随着生物信息学和分子生物学技术的不断发展,在原核生物体内陆续发现了上百种sRNA分子,这些sRNA分子具有多样的生物学功能。小RNAs作为一类新发现的基因表达调控子已经引起了高度的重视。它们在细菌中发挥着多种调控功能,有助于细菌对生理系统进行精细调控以便适应迅速变化的环境。因而深入认识这些sRNAs可能开辟一个新的研究领域,它们可能代表着一个新层次上的基因表达调控方式。人们现在已认识到sRNAs参与许多有机体的基因调节,在细菌中行使诸如翻译激活、翻译抑制、持家sRNAs、密度感应系统、蛋白的降解、离子动态平衡、糖代谢和生长依赖性外膜蛋白表达调控等多种功能,有人把这些sRNAs称为“凌驾于”基因组之上的调控成分。虽然现在细菌中发现的sRNAs在迅速增加,但是它们中的大部分功能都还未知,从目前积累的知识分析,细菌可能借助于这些sRNAs对它们的生理系统进行精细调控以便适应迅速变化的环境。因而深入认识这些sRNAs可能开辟一个新的研究领域,因为它们可能代表着一个新层次上的基因表达调控方式。功能分析表明sRNAs是进行细菌调控研究中一直被忽略的一环。最新认识到的sRNAs的生理功能已经填补了我们对细菌离子动态平衡、糖代谢和生长依赖性外膜蛋白表达调控知识的空白。对痢疾杆菌全基因组sRNAs的功能进行研究,必将促进对该菌生理学、系统进化以及致病机理等方面的研究,为痢疾的药物开发提供新的作用靶标,为痢疾杆菌疫苗研制提供一个新的思路。首先,本研究根据目前发现的大肠杆菌的sRNAs的本身的特点,利用生物信息学,根据基因组之间的序列对比、RNA的二级结构分析以及对非依赖性终止子分析等方法对福氏2a志贺氏菌301毒力大质粒(pCP301)上的sRNAs进行预测,采用Northern blot对预测出的sRNAs进行验证。本研究成功预测了301毒力大质粒上的6个sRNA;综合文献报道和网络信息初步预测sf301基因组5个功能未知的sRNA:IS061 sRNA、IS102 sRNA、C0719 sRNA、tke1 sRNA和ryfA sRNA(http://www.sanger.ac.uk)。研究证明sRNA在细菌的物质代谢、环境适应、群体感应和细菌毒力发挥了重要的调节作用。本研究采用改进的λ-Red重组系统成功构建了sf301的8个sRNAs的缺失突变体(简称sf301ΔsRNAs),分别是预测的3个质粒编码sRNAs和sf301基因组5个功能未知的sRNAs,并对突变株进行了生理生化特征研究。结果表明:这8个sRNA的缺失对菌体的物质代谢和生长影响不大。接下来本文对sf301ΔsRNAs对sf301毒力的影响进行了评价。本研究通过sf301ΔsRNAs与野生株的HeLa细胞竞争性侵袭力、小鼠肺部竞争性侵袭感染能力和豚鼠角膜侵染实验进行毒力评价研究,验证预测的sRNA和基因组上已报道但是功能未知的sRNA是否对细菌毒力的发挥起到了重要的调控作用。结果表明:基因组上的C0719 sRNA和IS061 sRNA的缺失造成了sf301的HeLa细胞侵袭力及小鼠肺部侵袭力的增强;毒力大质粒预测的ln3 sRNA的缺失使得sf301的HeLa细胞侵袭力及小鼠肺部侵袭力的减弱。对细菌不同状态下的蛋白质组进行比较是蛋白质学研究中很重要的一个方面,这包括同一株菌在不同培养条件下的蛋白质组的变化的研究、同一细菌的不同菌株的蛋白质组比较以及同一菌株的突变菌株和野生菌株的蛋白质组的比较。本研究采用蛋白质组学技术对sf301ΔsRNAs与sf301的蛋白质组进行比较,应用双向凝胶电泳建立了不同生长时期野生株和sRNAs突变株的双向电泳图谱,并对差异点进行了胶内酶切和质谱鉴定。结果表明:通过比较8株突变株37℃晚期的和sf301ΔIS061中期的蛋白质组,发现了31种蛋白质在突变株与野生株中存在差异,我们对这些蛋白进行了功能分析。发现sRNAs的缺失并没有对痢疾杆菌的蛋白表达量造成明显的影响,但是我们发现了可能对痢疾杆菌毒力造成影响的蛋白质OspC3和可能与sRNA调控机制有关系的蛋白质OmpA,为下一步研究sRNA的调控功能提供了条件。综上所述,本研究预测出pCP301的6个sRNAs,并进行验证;成功地构建了8株sf301ΔsRNAs突变体并根据生化特性变化、细胞和动物侵袭实验揭示出sRNAs与痢疾杆菌致病性之间的关系;通过与蛋白质组技术相结合分析sRNAs的调控功能。本研究构建的8株sf301ΔsRNAs为进一步研究sRNA的功能奠定了基础。