研究目的和背景:乳腺癌是一种女性最常见的恶性肿瘤,居于女性肿瘤相关死亡第二位,全球乳腺癌发病率自上世纪七十年代开始一直处于上升的趋势,严重危害广大妇女生命健康。乳腺癌的发生发展经历多个阶段,机制复杂,为很多因素共同作用的结果。近年来对乳腺癌相关肿瘤标志物的研究也取得了一定的成果,对于人类认识、了解以及诊断、治疗乳腺癌有着不可忽视的作用。随着社会经济的快速发展,筛查发现的无临床症状的患者不断增多,早期乳腺癌诊断率不断升高,患者5年生存率也明显提高。但是在我国由于筛查体系不健全,预防意识不足,诊断延迟导致晚期病例比例偏高,使我国乳腺癌生存率与发达国家相比还存在一定的差距。因此寻找特异性和灵敏度高的肿瘤标志物对乳腺癌的诊断和治疗具有重要意义。基因组学揭示了人类遗传图谱的基本特点,然而基因组学并不能揭示所有基因的功能及其调控机制。因为绝大部分基的功都依赖于其编码的蛋白质,蛋白质是生命活动的承担者、生物功能的直接执行者,所以从整体水平上对细胞或者机体蛋白质进行研究有助于我们揭示的代谢过程和生命。应用高通量的蛋白组学技术,结合生物信息学方法,从差异蛋白质入手对乳腺癌进行研究,拓宽了蛋白质研究的广度,有利于更高效、更全面、更精确的筛选乳腺癌的生物标志物。本研究由蛋白组学筛查对比差异蛋白入手,筛选乳腺癌发生发展过程中的值得研究的蛋白,为乳腺癌诊断治疗中标志物的发现提供理论基础和依据。研究方法:第一部分II期乳腺癌患者及健康女性血清差异蛋白的鉴定1、提取II期乳腺癌患者及健康女性血清蛋白。2、进行蛋白组学分析筛选一系列差异表达蛋白。3、对这些差异蛋白在Gene Co Dis3中进行GO注释分析和功能聚类分析;在Uniprot数据库里检索,对其进行功能分类与分析;结合变化倍数和在线工具STRING对差异蛋白相互作用分析,筛选认为值得进一步研究的蛋白。4、Western Blot、q RT-PCR对筛选出的差异蛋白进行进行验证。第二部分有腋窝淋巴结转移和无腋窝淋巴结转移乳腺癌患者血清差异蛋白的鉴定1、提取有腋窝淋巴结转移和无腋窝淋巴结转移乳腺癌患者血清蛋白2、进行蛋白组学分析筛选一系列差异表达蛋白3、对这些差异蛋白在Gene Co Dis3中进行GO注释分析和功能聚类分析;在Uniprot数据库里检索,对其进行功能分类与分析;结合变化倍数和在线工具STRING对差异蛋白相互作用分析,筛选认为值得进一步研究的蛋白。4 Western Blot、q RT-PCR对筛选出的差异蛋白进行进行验证。第三部分乳腺导管原位癌和导管原位癌伴浸润患者血清差异蛋白的鉴定1、提取乳腺导管原位癌和导管原位癌伴浸润组织蛋白。2、进行蛋白组学分析筛选一系列差异蛋白。3、对这些差异蛋白在Gene Co Dis3中进行GO注释分析和功能聚类分析;在Uniprot数据库里检索,对其进行功能分类与分析;结合变化倍数和在线工具STRING对差异蛋白相互作用分析,筛选认为值得进一步研究的蛋白。4、Western Blot、q RT-PCR对筛选出的差异蛋白进行进行验证。5、通过MTT法、Transwell细胞迁移实验来了解筛选标记物对细胞增殖及迁移能力等细胞生物学行为的影响。实验结果:第一部分:1、在II期乳腺癌和健康女性血清蛋白组学分析研究中共定量359个蛋白,其中26个上调表达的蛋白,41个下调表达的蛋白质。2、对差异蛋白进行GO功能注释与显著性富集分析,结合变化倍数和蛋白质相互作用分析,RAF1、VIME是值得进一步研究的蛋白。3、免疫印迹Western bolt实验显示,VIME蛋白在II期乳腺癌患者血清中表达水平明显高于对照组,而RAF1表达明显低于对照组;利用q RT-PCR探针法检测结果显示,VIM基因在有II期乳腺癌患者血清中表达较对照组极显著上调(P<0.01),而RAF1基因较对照组表达极显著下调(P<0.01)。经Western Blot与q RT-PCR验证,RAF1和VIME在乳腺癌中的表达与蛋白组学研究的结果相符.第二部分:1、在有腋窝淋巴结转移和无腋窝淋巴结转移乳腺癌患者血清蛋白组学分析研究中共定量346个蛋白,其中6个上调表达的蛋白,113个下调表达的蛋白质.2、对差异蛋白进行GO功能注释与显著性富集分析,结合变化倍数和蛋白质相互作用分析,K1C19、PSME2是值得进一步研究的蛋白。3、免疫印迹Western bolt实验显示,PSME2在有淋巴结转移乳腺癌患者血清中表达水平明显低于对照组,而K1C19表达明显高于对照组;利用q RT-PCR探针法检测结果显示,PSME2基因在有淋巴结转移乳腺癌患者血清中表达较对照组极显著上调(P<0.01),而KRT19基因较对照组表达极显著下调(P<0.01)。经Western Blot与q RT-PCR验证,K1C19和KRT19在乳腺癌中的表达与蛋白组学研究的结果相符.第三部分:1、乳腺导管原位癌和导管原位癌伴浸润性组织蛋白组学分析研究中共定量524个蛋白,其中11个上调表达的蛋白,43个下调表达的蛋白质。2、对差异蛋白进行GO功能注释与显著性富集分析,结合变化倍数和蛋白质相互作用分析,ACTC1是值得进一步研究的蛋白。3、免疫印迹Western bolt实验显示,ACTC1在导管原位癌伴浸润性组织中表达水平明显高于对照组;q RT-PCR探针法检测结果显示,ACTC1基因在导管原位癌伴浸润性组织表达较对照组极显著上调(P<0.01)。经Western Blot与q RT-PCR验证,ACTC1在乳腺癌中的表达与蛋白组学研究的结果相符.4、MTT比色法检测在MCF7细胞系中过表达ACTC1对其增殖的影响。选取24h、48h和72h三个时间点,分别检测ACTC1过表达组和对照组于490nm处的吸光值,结果发现ACTC1过表达组的吸光值均大于对照组。说明ACTC1对MCF7细胞的增殖有促进作用。5、Transwell细胞迁移实验显示,ACTC1过表达处理的MCF7细胞系迁移能力高于对照组。说明ACTC1对MCF7细胞的迁移有促进作用。结论:三个部分的实验分别对不同组别的乳腺癌的蛋白质进行的对比,筛选出了差异表达的蛋白,并对差异蛋白进行验证,结果与蛋白组学的结果一致。三个部分的实验中没有发现共同的差异蛋白,说明乳腺癌的发生发展原因复杂,是多阶段、多种因素共同作用的结果。第三部分为重点阐述的部分,对经过验证的ACTC1进行了进一步的研究。为了在研究ACTC1对乳腺癌细胞生物学行为的影响,通过MTT比色法检测在MCF7细胞系中过表达ACTC1对其增殖的影响,结果说明ACTC1对MCF7细胞的增殖有促进作用;通过Transwell细胞迁移实验,说明ACTC1对MCF7细胞的迁移有促进作用。目前ACTC1在肿瘤中的研究报道尚不多见,与ACTC1在胶质瘤中的研究结果相一致。经过研究我们认为蛋白组学技术是发现乳腺癌潜在生物标志物的有力手段。