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目的:特异性IgE抗体在变态反应性疾病中处于核心地位,其生物功能通过结合四聚体高亲和力IgE受体介导的。目前s IgE检测仍处于含量测定而非功能测定,与临床症状相关性并不高,因为它们仅仅表示IgE结合过敏原的强度,而不能反映结合过敏原的引起的致敏细胞的脱颗粒效应。高亲和力IgE受体在RBL细胞上的表达可用于检测过敏原特异性IgE和过敏原结合导致组胺、5-羟色胺等其他炎症介质的胞吐。实验表明,NPY与荧光蛋白融合表达可用于标记神经元细胞系PC12中的颗粒,NPY-m RFP也可以用来标记非神经元RBL细胞中的颗粒,用于定量细胞胞吐。我们假设稳定转染NPY-EGFP和FcεRIα的RBL细胞可以应用于研究人类患者血清中的致敏作用。方法:1.瞬转细胞系:利用脂质体lipo2000转染载体质粒检验质粒和细胞实用性。应用荧光定量PCR,蛋白免疫印迹,流式细胞术,免疫荧光技术和介质释放试验鉴定受体FcεRIα的基因水平,蛋白量水平,蛋白膜表达情况及功能状况。2.稳转细胞系:通过不同次代慢病毒颗粒包装载体质粒优化转染条件,利用细胞增殖实验确定药物筛选浓度和慢病毒感染量,最后感染RBL-2H3细胞建立稳定细胞系,应用流式细胞术和免疫荧光技术鉴定受体表达情况。3.稳转细胞学初步应用:利用介质释放试验鉴定稳定细胞系对过敏原Gal d 6检测的特异性和灵敏度。结果:1.对瞬转细胞系进行的qPCR结果,实验组FcεRIα过表达相对对照组165.91倍,以此瞬时转染RBL-2H3细胞受体基因表达。免疫印迹结果:使用抗人FcεRIα的特异性单克隆抗体检测实验组在50 k D处检测到一条明显的蛋白条带。使用PE标记的抗人FcεRIα的特异性单克隆抗体识别的对照组和目的组细胞中FcεRIα表达情况,目的组阳性细胞率达83.2%。使用BLG过敏阳性血清和阴性血清做介质释放实验,刺激阳性血清可做到20%-60%之间,阴性在10%以下。用相同血清标本,更换换新型指标NPY-EGFP检测释放率。释放率在20%-80%不等,与阴性血清可明显区分。2.对稳转细胞系的构建采用第二代,第三代,第四代慢病毒包装颗粒进行包装载体质粒,发现第二代具有最佳包装效果。通过MTS细胞增殖试验确定Puromycin药物筛选浓度为1.61μg/m L。利用MTS细胞增殖试验确最佳感染慢病毒量为1.53倍病毒原液。用流式细胞术检测阳性克隆,膜蛋白表达阳性细胞率95.5%。3.利用介质释放试验鉴定稳定细胞系对过敏原Gal d 6特异性试验显示Gal d 6能有效刺激Gal d 6过敏血清致敏的RBL细胞,而Bos d 5不能(p<0.0001)。稳定细胞系对Gal d 6的检测灵敏度0.01μg/m L。结论:本研究建立的基于细胞生物学检测过敏原刺激致敏稳转RBL-2H3的细胞系具有实用性。