【摘 要】
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抗冻蛋白(antifreeze proteins,AFPs)是一类能控制冰晶生长和抑制冰晶之间发生重结晶的蛋白质,能在结冰或亚结冰条件下保护生物体不受伤害.AFPs具有两种明显不同的活性--热滞
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抗冻蛋白(antifreeze proteins,AFPs)是一类能控制冰晶生长和抑制冰晶之间发生重结晶的蛋白质,能在结冰或亚结冰条件下保护生物体不受伤害.AFPs具有两种明显不同的活性--热滞(thermal hysteresis,TH)活性和重结晶抑制(recrystallizationinhibition,RI)活性.植物AFPs的特征是低TH活性高RI活性,虽然这种特性的分子机理目前还处于探索阶段,但与鱼类和昆虫AFPs相比,植物AFPs更适合于植物转化、食品的冷冻保藏和细胞、组织、器官等的低温保存.将从中国胡萝卜栽培品种中克隆的胡萝卜抗冻蛋白(DcAFP)的基因在大肠杆菌BL21(DE3)中进行了高效的表达.通过优化它的表达条件,确定了一种经济、简便的纯化方法:Native-PAGE纯化法,提出了一个可与TH活性测定法互为补充的细菌0℃冷处理法,并成功用来检测重组表达的DcAFP及其突变体的体外抗冻活性,活性检测表明,目的蛋白不仅展示了适度的TH活性,而且还能有效地增强细菌的抗冷性.通过同源建模方法获得了DcAFP的理论三维结构.从DcAFP的TH活性发生变化的系列突变体中,选择一个TH活性降低的突变体pC2300-35S-N178V以及两个TH活性增强的pC2300-35S-P82N和pC2300-35S-T106N进行了转化烟草的研究.由于具有LRR重复单元的DcAFP属于PGIP(多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白)家族,因而通过酵母双杂交来分析DcAFP是否还保留着微弱的PGIP活性.在通过RT-PCR克隆了真菌互格链格孢(Alternaria alternata)的PGase cDNA的基础上,分别将DcAFP与PGase的完整编码框克隆到酵母双杂交系统的诱饵载体和捕获载体中,经过预实验表明两者都不能产生自激活作用.
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