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冷季型草坪草以其绿期长、草坪质量高,具有美化和观赏效果,并能供人休闲、游乐和适度的体育运动,而倍受人们的亲睐。草地早熟禾、高羊茅和多年生黑麦草都是最广泛种植的冷季型草坪草种。近年来全球水分紧缺,土壤盐化、次生盐渍化不断加剧,而种植抗早、耐盐的草坪草能减少水分蒸发,抑制盐碱地土壤返盐,还可以用含一定盐分的水来灌溉,节省水资源。同时在北方及过渡地带,许多草坪草品种都遭受到不同程度冻害,严重影响草坪景观。本研究的目的是通过基因工程的方法将SOS1、SOS2、SOS3、CBL10基因转入草地早熟禾、高羊茅和多年生黑麦草,提高其耐盐、耐低温或抗旱能力。本研究主要在这方面取得了以下结果:
建立了草地早熟禾、高羊茅和多年生黑麦草胚性愈伤组织高频诱导与再生体系。研究结果表明,成熟胚是诱导愈伤组织最理想的外植体,经50%硫酸处理缩短其出愈时间并降低愈伤组织污染率。三种冷季型草坪草愈伤组织再生体系已完全具备了遗传转化受体系统的基本条件,这一结果将为今后草地早熟禾、高羊茅和多年生黑麦草同种的草坪草的遗传转化受体系统的建立奠定牢固的基础,也是冷季型草坪草的品种改良迈出的最重要的第一步。
本研究利用农杆菌介导技术首次对早熟禾、高羊茅和多年生黑麦草同时进行多基因SOS1、SOS2、SOS3、CBL10遗传转化,实验结果表明,本研究在试验过程中借鉴了农杆菌转化小麦愈伤组织的部分技术,包括液体共培养基、分化培养基、筛选技术和共培养技术,取得了比较理想的转化效果,解决了农杆菌污染严重、转化效率低的问题。
应用本研究优化的遗传转化方法,首次获得了转SOS1、SOS2、SOS3、CBL10基因优异、爱瑞三号、爱神特植株。通过除草剂筛选获得了91株独立来源的转化植株。选取部分植株进行PCR、Southern杂交分子检测的结果表明,外源基因已整合到转基动植株的基动组,Northern杂交结果表明外源基因在草坪草中基因组中得以表达。
对转基因植株的叶片采用标记涂抹除草剂,进行抗除草剂检测,对检测得到的转基因株系T0代进行盆栽实验,经盐、早胁迫处理,进行形态学、生长表型的观察比较。检测转基动植株在不同盐浓度条件下生理生化指标,结果表明:在盐胁迫条件下,转化株及对照株在质膜透性、体内游离脯氨酸含量、丙二醛含量、超氧化物歧化酶活性、过氧化氢酶活性、均出现显著变化。