目的:构建人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因的RNA干扰(RNAi)表达载体,并探讨该表达载体对人乳腺癌细胞系MCF-7细胞中hTERTmRNA表达的特异性抑制作用,为蛋白水平及细胞水平的进一步研究奠定实验基础。研究不仅为针对hTERT基因的RNA干扰提供新的有效的作用靶位,而且为体内表达载体介导的RNA干扰作为一种有效的基因沉默技术的应用提供新的实验依据,为针对端粒酶的乳腺癌基因治疗提供新的途径,同时也对RNAi在肿瘤研究和基因治疗方面应用的可能性进行有益的探索。方法:设计针对hTERT基因的干扰靶序列TGTTCAGCGTGCTCAACTA,合成具有该靶序列短发夹结构的两条寡核苷酸,其排列顺序为BamHⅠ酶切位点、19nt正义序列、9nt loop序列、19nt反义序列、RNA聚合酶Ⅲ终止子(6个T)、SalI酶切位点、HindⅢ酶切位点。合成后经退火形成双链DNA。将pGenesil-1表达载体经BamHI、HindIII双酶切后电泳分离,纯化回收4800bp左右的大片段。将退火形成的双链DNA通过T4 DNA连接酶连接到线性化pGenesil-1质粒U6启动子下游,构建重组siRNA表达质粒pGenesil-hTERT。再将重组质粒转化用CaCl2法制备的感受态细胞DH5α,经Kanar抗性筛选,挑选阳性克隆菌落进行摇菌扩增,并抽提纯化质粒,然后将抽提的重组质粒分别做PstI和SalI单酶切和琼脂糖电泳分析,同时做测序鉴定以确定插入的干扰片段准确无误,即针对hTERT基因的siRNA表达载体构建成功。同时完成不针对任何基因的阴性对照重组质粒的构建。培养MCF-7细胞,待细胞生长状态良好并达到指数生长期时,于转染前一日接种于6孔板中,并设置空白组、脂质体组、阴性对照组及pGenesil-hTERT组。以每孔脂质体7.5μl、重组质粒3μg配成转染复合物,加入各孔MCF-7细胞中进行转染(脂质体组用无菌水代替质粒,空白组不加任何试剂),转染后48h重组质粒上带有的EGFP基因得以表达,荧光显微镜下观察绿色荧光细胞所占比例,以此来判断转染效率。接着用TRIzol