研究背景心血管疾病的高发病率、高致残率以及高致死率的特点成为威胁人类健康的“头号杀手”,对心血管疾病的预防和治疗依然是全世界范围内面临的重要公共卫生问题。流行病学研究发现,血浆低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）水平的升高是导致动脉粥样硬化及冠状动脉心脏病最重要的独立危险因素。既往研究已证实,在75岁左右的老年人群中,LDL-C的水平每降低1.0 mmol/L,其相应的心血管事件的发生风险降低22%。人体血浆中大部分的LDL主要是通过肝细胞的低密度脂蛋白受体（LDLR）介导的内吞（endocytosis）作用而被细胞所摄取,其余的一小部分LDL可通过清道夫受体（scavenger receptor）以及周围组织的非受体介导途径所清除。LDLR结合配体后聚集在细胞膜表面通过网格蛋白（clathrin）包被的凹坑（coated pits）介导的内吞作用进入细胞。随后受体配体复合物在内体（endosome）的酸性环境下解离,受体返回至细胞膜进行下一次的循环。LDLR表达或功能异常均可以导致血浆胆固醇代谢紊乱最终引起高胆固醇血症。治疗高胆固醇血症的主要目标是有效降低血浆LDL-C的水平,目前人们主要将上调LDLR的蛋白表达作为降低胆固醇最有效的药物调控靶点。当前应用于临床的一线药物是他汀类。然而他汀类药物存在使患者产生横纹肌溶解、骨骼肌疼痛等毒副作用的风险,还会在上调LDLR表达的同时促进PCSK9（枯草溶菌素转化酶9）的高表达,这种负反馈作用可能限制他汀类药物的最佳药理作用。PCSK9能够与LDLR结合,进而介导LDLR进入溶酶体并降解,是LDLR的关键负调控因子。目前靶向PCSK9的单克隆抗体被证明是继他汀药物之后的另一个能有效治疗高胆固醇血症的方法。然而PCSK9单克隆抗体也面临成本高、治疗依从性低等问题,并且其长期安全性与耐受性证据尚不充分。因此,在他汀和PCSK9抑制剂之外寻找新的降脂药物靶点仍然具有重要的临床意义和应用价值。Rab家族小G蛋白可以通过向内体表面募集特定的效应因子来调控细胞内膜性囊泡系统的结构和功能,从而起到调控囊泡出芽（budding）、靶向定位（docking）和促进融合（fusion）、运输（trafficking）的作用。研究表明,内吞后的LDL-LDLR复合体通常被运送到早期胞内体（early endosome）中进行分选（sorting）,分选后的LDLR一方面可以通过Rab4介导的快循环（fast recycling）途径返回至细胞膜表面;另一方面也可以被运输至位于细胞核周的内吞再循环小泡（endocytic recycling compartment/ERC）区域,再经过Rab11介导的慢循环（slow recycling）通道返回至胞膜。迄今为止,针对调控LDLR的转录水平以及转录后水平的研究已经取得了很大进展,但是关于LDLR转运循环途径的调控机制尚缺乏广泛深入的研究。前期有研究显示,在不改变受体数量的前提下,通过促进分选蛋白SNX17与LDLR的结合加速受体通过早期胞内体返回至细胞膜的机制,可以将LDL内吞速率提高两倍。还有研究表明,胰岛素可以通过Akt信号通路调控葡萄糖转运蛋白Glut4的囊泡运输,增加细胞对葡萄糖的摄取。然而,类似对Glut4囊泡转运的信号调控机制在LDLR转运研究领域还未见报道。因此深入探讨LDLR转运循环途径的调控机制,进一步寻找影响LDLR转运循环的潜在靶点对发现新的治疗高胆固醇血症的方法具有重要的临床意义。氨基酸是蛋白质的基本组成单元,对于维持细胞的正常新陈代谢和生长至关重要。近期有少量研究发现在动物实验模型中,在不限制总热量摄入的前提下限制蛋白质的摄入量,不仅可以有效降低体脂和体重,还可以显著提高机体的葡萄糖耐受和对胰岛素的敏感性,从而降低糖尿病的患病风险。还有研究发现:减少膳食中苏氨酸的摄入量可以降低肥胖小鼠血清中的甘油三脂水平;在不限制热量摄入的情况下,控制饮食中的蛋白质含量也可以明显降低小鼠血清中VLDL水平。目前已知细胞在应对氨基酸匮乏时会启动自噬反应。近期研究还发现:在氨基酸缺乏的微环境条件下,肿瘤细胞会首先激活内吞作用摄取细胞外的大分子物质作为氨基酸的补充来源。我们推测其中依赖于LDLR介导的内吞途径摄取的外源性脂蛋白颗粒（例如LDL和VLDL）可能是理想的营养物质来源。我们课题组前期通过氨基酸饥饿（amino acid starvation,AAS）模拟细胞营养应激的环境,发现AAS可以促进细胞摄取LDL,而且该作用依赖于网格蛋白介导的内吞途径。结合之前的研究和课题组前期观察,本论文将进一步阐明AAS促进细胞摄取LDL作用的相关调控机制,完善我们对调控LDLR内吞循环的信号通路的认知,为寻找新的降脂药物靶点提供初步思路和理论依据。研究目的1.鉴定AAS促LDL吞噬作用的细胞生物学特征。2.探索AAS调节LDLR细胞内转运的机制。3.在动物模型中探讨AAS促LDL吞噬作用的病理生理学意义。研究方法第一部分鉴定AAS促LDL吞噬作用的细胞生物学特征1.1 AAS对HepG2细胞摄取LDL的影响:体外培养人肝癌细胞系HepG2,首先加入DiI荧光标记的LDL（DiI-LDL,10 μg/mL）并给予AAS处理,荧光显微镜以及流式细胞术检测不同时间点（15、30、60、120、240 min）后细胞对LDL的摄取;接下来通过荧光显微镜检测不同强度的AAS（培养基含100%、75%、50%、25%、0%正常水平的氨基酸）对细胞摄取LDL的影响。1.2 AAS诱导细胞摄取LDL作用的特异性:体外培养HepG2细胞,检测氨基酸回补（replenish）是否能逆转AAS培养基处理对细胞摄取LDL的影响;接下来给予细胞血清剥夺或是葡萄糖剥夺处理1 h,检测不同营养剥夺条件对细胞摄取LDL的影响。1.3 AAS的促吞噬作用与自噬的关系:用Rapamycin（5μM）刺激HepG2细胞0、0.5、1、2 h,通过免疫蛋白印迹以及荧光显微镜检测自噬相关蛋白LC3B的表达以及细胞摄取LDL的变化;沉默Atg5表达后检测AAS对细胞摄取LDL的影响是否改变。。1.4 AAS的促吞噬作用与LDLR介导的内吞途径的关系:提取并培养野生型（WT）以及LDLR-/-小鼠的原代肝脏细胞及脂肪间充质干细胞,给予AAS处理1 h,荧光显微镜检测细胞对LDL的摄取情况。1.5 AAS的促吞噬作用与LDLR基因表达的关系:首先对HepG2细胞用AAS处理0、30、60、120 min,通过免疫蛋白印迹以及实时定量PCR的方法分别检测LDLR的蛋白和 mRNA 的表达;分别用 actinomycin D（10 μg/mL）和 cycloheximide（30μg/mL）预处理4 h阻断细胞内mRNA和蛋白合成途径,然后检测AAS对细胞LDL摄取的作用有何变化。1.6 AAS的促吞噬作用与LDLR在细胞膜表面分布的关系:HepG2细胞用AAS处理不同时间点,通过生物素化细胞膜蛋白、免疫荧光和流式细胞术的方法检测AAS对细胞膜表面LDLR丰度的影响。第二部分探索AAS调节LDLR转运的机制2.1 AAS对LDLR细胞内空间分布的影响:在NIH-3T3细胞中,首先使用免疫荧光检测AAS对LDLR在细胞内空间分布的影响;用免疫荧光双标实验检测LDLR与Rab4、Rab11、EEA1、Rab5、Rab7 以及 Vps35 的共定位情况。2.2 AAS对胞内LDLR再循环（recycling）速率的影响:NIH-3T3细胞用AAS处理,通过生物素标记追踪实验,检测AAS对胞内LDLR再循环速率的影响。2.3 AAS的作用与Rab4介导的快循环通路之间的关系:构建Rab4激活突变体（constitutively active mutant）Rab4a-Q67L、Rab4 失活突变体（dominant negative mutant）Rab4a-S22N 以及 Rab4 野生型（wild type）Rab4a-WT 三种质粒。在 NIH-3T3细胞中转染不同质粒后检测AAS作用的变化。基因沉默Ra4a后检测AAS对LDL摄取的影响有何变化;最后通过免疫荧光双标实验检测转染不同Rab4a质粒后LDLR与Rab4a在细胞内的分布和共定位情况。2.4 AAS的作用与GCN2信号通路的关系:首先在HepG2细胞中敲低GCN2的表达,然后用荧光显微镜检测AAS的促LDL吞噬作用有何变化;其次用不同浓度的GCN2的竞争性抑制剂GCN2iB（0、1、2 μM）处理NIH-3T3细胞4 h,然后检测AAS的促LDL吞噬作用有何变化。2.5 AAS的作用的分子机制2.5.1 AAS的作用与细胞内Ca2+信号的关系:NIH-3T3细胞用荧光探针Fluo-3AM（2μM）标记30 min,给予AAS刺激,然后回补氨基酸,通过共聚焦显微镜观察细胞在不同条件下细胞内Ca2+浓度的变化情况。用Ca2+螯合剂BAPTA-AM（5 μM）预处理细胞4 h,用荧光显微镜和流式细胞术分别检测AAS对细胞LDL摄取以及细胞膜表面LDLR分布的作用有何变化。用Ca2+跨膜载体A23187（2 μM）处理细胞2 h,检测A23187能否模拟AAS对LDL摄取及细胞膜表面LDLR分布的作用,用免疫荧光双标实验检测A23187对LDLR/Rab4a共定位情况的影响。2.5.2 AAS的作用与CaMK Ⅱ的关系:NIH-3T3细胞用AAS处理不同时间点（0、60、120 min）后用蛋白免疫印迹检测 calcium/calmodulin-dependent protein kinase Ⅱ（CaMK Ⅱ）的磷酸化情况;用CaMK Ⅱ特异性抑制剂KN-93（5 μM）以及CaMK Ⅰ/CaMK Ⅳ的抑制剂STO-609（5 μM）预处理细胞4 h,检测AAS对细胞LDL摄取以及细胞膜表面LDLR分布的作用有何变化。2.6 CaMK Ⅱ介导的Rab4a磷酸化在AAS作用中的角色2.6.1 CaMK Ⅱ介导的Rab4a磷酸化:人工合成野生型Rab4a C 120-154)片段（Rab4a120-154-WT）和含有 T137A 点突变的肽段（Rab4a120-154-T137A）,通过体外磷酸化实验检测CaMK Ⅱ是否能介导Rab4磷酸化。2.6.2 AAS对Rab4a磷酸化的影响:NIH-3T3细胞中外源性表达Rab4a-WT和Rab4a-T137A,给予AAS处理1 h,用免疫沉淀法检测外源性Rab4a的丝/苏氨酸磷酸化水平;用CaMK Ⅱ特异性抑制剂KN-93（5 μM）预处理细胞4 h,检测AAS对Rab4a磷酸化的影响是否改变。2.7 Rab4a磷酸化在AAS作用中的角色:NIH-3T3细胞内分别过表达Rab4a-WT或Rab4a-T137A,荧光显微镜检测AAS对细胞LDL摄取的作用有何变化;利用生物素化膜蛋白实验收集细胞膜蛋白,用蛋白免疫印迹检测AAS对细胞膜表面LDLR丰度的作用有何变化。2.8 AAS对Rab4a-Rebenosyn-5相互作用的影响:NIH-3T3细胞中外源性表达Rab4a-WT和Rab4a-T137A,给予AAS处理1 h,免疫沉淀法检测Rab效应蛋白Rebenosyn-5与野生型Rab4a和Rab4a-T137A突变体的相互作用及AAS的影响。用KN-93（5μM）预处理表达Rab4a-WT的细胞4 h,检测AAS对Rab4a-Rebenosyn-相互作用的影响有何变化。第三部分在动物模型中探讨AAS促LDL吞噬作用的病理生理学意义3.1急性膳食氨基酸剥夺对小鼠血液LDL-C清除的影响及机制:野生型小鼠给予0、24、48、72 h氨基酸剥夺饮食处理,通过尾静脉注射DiI标记的人源LDL（5 mg/kg）后2 h取材。肝脏冰冻切片荧光显微镜检测肝细胞对DiI-LDL的摄取;荧光酶标仪检测肝脏组织匀浆中DiI-LDL水平;蛋白免疫印迹检测小鼠肝脏组织中人源ApoB的含量。分别提取肝脏组织总蛋白及细胞膜蛋白,蛋白免疫印迹法检测LDLR的水平。3.2限制膳食蛋白摄入对小鼠高胆固醇血症的影响:LDLR基因缺失杂合子小鼠高脂饮食喂养构建高胆固醇血症模型,对照组给予正常水平的膳食蛋白摄入,干预组给予热量对等的低蛋白（50%）膳食,2周和4周后采集血液,生化检测和/或快速蛋白质液相色谱（FPLC）法检测各组小鼠血清中总胆固醇（TC）、LDL-C、极低密度脂蛋白胆固醇（VLDL-C）和高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）的变化。实验结果第一部分鉴定AAS促LDL吞噬作用的细胞生物学特征1.1 AAS促进HepG2细胞摄取LDL:与对照组相比,AAS刺激（15-240 min）可以显著增加细胞摄取外源性LDL颗粒,且这种促吞噬作用随着时间的增加而增强;AAS促LDL吞噬的作用显示强度依赖性:去除培养基中100%-50%的氨基酸对细胞摄取LDL有显著增加作用,而去除培养基中25%的氨基酸对LDL摄取没有明显作用。1.2 AAS诱导细胞摄取LDL作用的特异性:结果显示,向AAS培养基中补足氨基酸后其促LDL吞噬的作用被逆转。与对照组相比较,血清剥夺或葡萄糖剥夺对细胞摄取LDL的能力均无显著影响。1.3 AAS促吞噬作用不依赖于自噬途径:自噬诱导剂Rapamycin处理细胞0.5 h即可激活自噬反应（LC3B Ⅱ蛋白水平增加）,然而rapamycin并不影响细胞对LDL的摄取;沉默Atg5表达对AAS的促LDL吞噬作用无显著影响。1.4 AAS促吞噬作用依赖于LDLR介导的内吞途径:在WT小鼠的原代肝脏细胞以及脂肪间充质干细胞中,AAS均显著增加细胞对LDL的摄取,而在LDLR-/-小鼠细胞中,AAS促LDL吞噬的作用消失。1.5 AAS促吞噬作用不依赖于上调LDLR的表达途径:与对照组相比,AAS处理（0-120 min）对LDLR的mRNA和蛋白表达水平均无显著影响;Actinomycin D和cycloheximide药物预处理对AAS的促LDL吞噬作用也没有显著影响。1.6 AAS促进细胞摄取LDL的作用依赖于增加LDLR在细胞膜表面的分布:生物素追踪表面膜蛋白实验、流式细胞术实验以及细胞免疫荧光实验均显示AAS刺激可以显著增加细胞膜表面LDLR的丰度。第二部分探索AAS调节LDLR转运的机制2.1 AAS调控LDLR在细胞内的空间分布:免疫荧光检测显示,在静息状态下的细胞中绝大部分的LDLR分布在核周围区域,AAS刺激促使LDLR远离核周,呈现出向胞浆发散分布的趋势。分布于细胞核周围的LDLR与Rab11以及Rab4均显示出有共定位,提示静息状态下LDLR主要分布于核周的ERC区域。免疫双标结果显示AAS增加了 LDLR与Rab5、EEA1以及Rab4在远离细胞核的胞浆区域中的共定位。与此相反,LDLR与Rab7和Vps35的共定位不受AAS处理的影响。2.2 AAS增加LDLR的循环速率:用生物素标记实验直接检测LDLR再循环速率的实验发现AAS刺激加快了胞浆中LDLR返回至细胞膜表面的速度（从峰值降至基线的速度）,同时AAS也加快了细胞膜表面LDLR内化至胞浆中的速度（从基线上升至峰值的速度）。2.3 AAS的作用依赖于Rab4介导的快循环通路:过表达Rab4a-S22N（dominant negative）可以抑制AAS的促吞噬作用;相反,在正常细胞中过表达Rab4a-Q67L（constitutively active）可以模拟AAS的促吞噬效应。过表达Rab4a-WT对基础状态下的LDL吞噬过程没有影响,但是进一步增强了 AAS的促吞噬作用。敲低Rab4a的表达可以削弱AAS的促吞噬作用。外源性表达Rab4a-Q67L后,Rab4a-Q67L与LDLR在胞浆区域呈现大量共定位;相反,外源性表达的Rab4a-S22N仅在核周区域与LDLR呈现部分共定位。2.4 AAS的作用的分子机制不依赖于GCN2信号通路:已知AAS能够激活经典的GCN2激酶通路。我们发现敲低GCN2表达或用GCN2抑制剂GCN2iB预处理细胞对AAS的促吞噬作用均没有显著影响。2.5 AAS作用的信号传导机制2.5.1 AAS通过激活细胞内的Ca2+信号通路而发挥作用:Ca2+荧光标记显示AAS可明显升高细胞内的Ca2+浓度;BAPTA-AM预处理可逆转AAS引起的促LDL吞噬和增加细胞膜表面LDLR丰度的作用;A23187处理不仅可以模拟AAS对LDL吞噬和LDLR分布的效应,还可以增加LDLR与Rab4a在远离核周的胞浆区域的共定位。2.5.2 AAS增加Ca2+信号通路下游中的CaMK Ⅱ磷酸化水平:AAS处理可以显著增加CaMK Ⅱ（Thr286）的磷酸化水平;KN-93预处理有效逆转了 AAS对LDL吞噬和LDLR分布的效应;STO-609预处理对AAS的作用无显著影响。2.6 AAS通过CaMK Ⅱ介导的Rab4a磷酸化而发挥作用2.6.1 CaMK Ⅱ介导的Rab4a磷酸化:用活化的重组CaMK Ⅱ进行体外磷酸化实验检测对Rab4a120-154-WT片段（包含潜在的CaMK Ⅱ底物域）的磷酸化作用,结果显示CaMK Ⅱ能够催化Rab4a120-154-WT磷酸化。相反,如果将137位苏氨酸突变（Rab4a120-154-T137A）,则 CaMK Ⅱ对Rab4a120-154-T137A没有磷酸化作用。2.6.2 AAS对Rab4a磷酸化水平的影响依赖于CaMK Ⅱ介导的信号通路:通过蛋白免疫共沉淀的方法检测过表达后AAS对Rab4a磷酸化水平的影响。结果显示,在NIH-3T3细胞中外源性表达Rab4a-WT或Rab4a-T137A,AAS刺激可以增加Rab4a-WT的磷酸化水平,对Rab4a-T137A的磷酸化水平没有影响;AAS促进Rab4a磷酸化的作用可以被KN-93抑制。2.7 AAS的作用依赖于Rab4a的磷酸化:通过荧光显微镜检测过表达Rab4a-WT以及质粒后,AAS对细胞LDL摄取的作用有何变化。结果显示,在NIH-3T3细胞中外源性表达Rab4a-T137A,在表达水平较高的细胞中我们观察到AAS促吞噬的作用被削弱;而在表达水平较低的细胞中,AAS的促吞噬作用依旧明显。蛋白免疫印迹实验显示过表达Rab4a-T137A可以部分阻断AAS增加LDLR在细胞膜表面分布的作用。2.8 AAS通过Ca2+/CaMK Ⅱ介导的信号通路增加Rab4a与Rebenosyn-5结合:免疫共沉淀结果显示AAS刺激可以明显增加Rab4a-WT与Rebenosyn-5的结合,相反AAS不影响 Rab4a-T137A 与 Rebenosyn-5 的结合。AAS 增加 Rab4a-WT 与 Rebenosyn-5 结合的作用可被KN-93抑制。第三部分在动物模型中AAS促LDL吞噬作用的病理生理学意义3.1急性膳食氨基酸剥夺对小鼠血液LDL-C清除的影响及机制:通过追踪外源注射的DiI标记的人LDL,在肝脏组织切片、肝脏组织匀浆中均发现急性膳食氨基酸剥夺处理显著促进小鼠肝脏细胞对LDL的摄取。肝脏组织蛋白免疫印迹检测显示氨基酸剥夺增加了小鼠肝组织中人源ApoB蛋白的含量;氨基酸剥夺增加了肝细胞膜组分中LDLR的丰度,而总LDLR蛋白水平没有明显变化。免疫共沉淀结果显示氨基酸剥夺显著增加了肝脏细胞中Rab4a的磷酸化水平及Rab4a/Rebenosyn-5的相互作用。3.2限制膳食蛋白摄入对小鼠高胆固醇血症的影响:在LDLR基因缺失杂合子小鼠加高脂饮食喂养构建的高胆固醇血症模型中,给予热量对等的低蛋白（50%）膳食2周和4周后显著降低了血清TC和LDL-C水平。FPLC结果显示干预膳食蛋白（氨基酸）摄入降低了血清胆固醇中LDL-C及VLDL-C组分的含量,而HDL-C组分的水平没有明显改变结论在细胞水平,氨基酸饥饿应激可触发细胞内LDLR向细胞表面转运,导致LDL内吞作用增强。这种反应是由Ca2+和CaMK Ⅱ依赖的信号传导途径介导的,该信号可将细胞内LDLR重新分配到快速循环途径。在整体水平,限制膳食蛋白质（氨基酸）摄入可加快肝脏摄取LDL,促进血液中LDL颗粒的清除。在LDLR+/-杂合子小鼠中,限制膳食氨基酸摄入可改善高脂诱导的高胆固醇血症。创新性1.我们首次阐明AAS的促吞噬作用不依赖于自噬以及上调LDLR表达途径,而依赖于增加LDLR再循环速率。2.在AAS的作用机制研究中,我们首次发现AAS通过细胞内的Ca2+/CaMK Ⅱ介导的信号通路对Rab4a发生磷酸化作用,继而激活Rab4a介导的快循环通路,上调LDLR再循环速率,最终发挥促进细胞摄取LDL的作用。3.限制膳食中的氨基酸可以在小鼠体内起到加速清除血液循环中胆固醇的作用。该现象的发现为高胆固醇血症新药的研发提供全新的初步治疗靶点以及理论基础。局限性1.我们阐明了 AAS是通过激活细胞内的Ca2+信号通路而发挥促吞噬的作用,但是细胞内升高的Ca2+是来源于胞内钙库的释放还是源自于胞外还不得而知,需要进一步的研究。2.我们发现了 AAS促进细胞膜表面LDLR分布增多的现象,但是AAS是否会对其他的载货受体产生类似的作用还需进一步的研究。