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目的:本研究拟采用LMTK3基因沉默的甲状腺乳头状癌细胞株作为研究对象,探讨LMTK3在甲状腺乳头状癌细胞增殖、侵袭转移和凋亡等生物学行为中的作用;了解LMTK3是否参与调控甲状腺乳头状癌细胞增殖、侵袭转移和凋亡的信号传导通路。方法:1.LMTK3、ERα、ERβ和AR在两种甲状腺乳头状癌细胞株中的差异表达研究:采用q RT-PCR和Western blot方法检测两种甲状腺乳头状癌细胞株中LMTK3、ERα、ERβ和AR的表达情况,选出LMTK3高表达且ERα和ERβ有表达的甲状腺乳头状癌细胞株;2.慢病毒载体感染被选择的甲状腺乳头状癌细胞株及验证实验:用携带短发夹LMTK3(short hairpin LMTK3,sh LMTK3)的重组慢病毒载体及其对应的空载对照慢病毒颗粒分别感染LMTK3高表达且ERα和ERβ有表达的PTC细胞株,并设为LV-sh LMTK3实验组(沉默的三个序列分别表示为LV-sh LMTK3-1、LVsh LMTK3-2和LV-sh LMTK3-3)和LV-Control阴性对照组;空白对照组(Control组)细胞常规培养,不作任何处理。感染72 h后,运用Western blot和CCK-8实验分别检测各组细胞中LMTK3的蛋白表达水平和细胞活性,选择合适的实验组和对照组进行后续实验;3.LMTK3对甲状腺乳头状癌细胞增殖、克隆形成、侵袭转移及凋亡能力影响的研究:CCK-8实验检测被选择细胞的增殖活性;克隆形成实验检测被选择细胞的克隆形成能力;划痕实验和Transwell实验检测细胞迁移和侵袭能力的变化;流式细胞术检测LMTK3对细胞凋亡的影响;4.在m RNA表达水平上探究LMTK3参与甲状腺乳头状癌细胞株增殖、侵袭转移和凋亡的信号传导通路:LMTK3基因沉默慢病毒载体感染甲状腺乳头状癌细胞株后,首先于倒置显微镜下观察LMTK3表达对细胞形态的影响;运用q RT-PCR检测上述被选择细胞中下述因子m RNA的表达变化:LMTK3、ERα、ERβ、AR、MEK、ERK、AKT、PKC、TGF-β1,上皮标记因子E-cadherin,间质标记因子N-cadherin和Vimentin,EMT相关转录因子Twist、Snail1和Snail2,转移相关因子MMP-2、MMP-3和MMP-9,肿瘤细胞生长周期相关蛋白依赖性激酶CDK2、CDK3、CDK4和CDK6,凋亡相关因子Bcl2、Bax和Capsase3;5.在蛋白表达水平上探究LMTK3参与甲状腺乳头状癌细胞株增殖、侵袭转移和凋亡的信号传导通路:通过Western blot检测在LMTK3干扰前后下游关键信号分子ERα、ERβ、β-catenin的蛋白表达变化以及ERKl/2和AKT总蛋白和磷酸化蛋白水平的变化。结果:1.LMTK3 m RNA在BCPAP和TPC-1细胞中的表达水平没有统计学差异,因此选择LMTK3蛋白相对高表达(P=0.0275)且ERα和ERβ均有表达的BCPAP细胞作为研究对象;2.用干扰效率达到80%以上的细胞做下述实验,Western blot实验显示LV-Control组和空白对照组间蛋白的表达水平没有统计学差异(P=0.2677),LV-sh LMTK3组细胞中LMTK3蛋白的表达水平明显低于LV-Control组细胞中的表达水平(分别为P=0.0055,P=0.0024和P=0.0003);细胞增殖实验结果与免疫印迹实验结果一致(分别为P=0.4987,P=0.3086,P=0.0030和P=0.0046);由于LV-Control组和空白对照组细胞中LMTK3蛋白的表达水平和细胞增殖实验结果均无统计学差异,因此本课题组认为空载慢病毒载体对细胞的影响较少,统计学上没有差异,接下来的实验只以LV-sh LMTK3组细胞和LV-Control组细胞作为研究对象;3.CCK-8实验检测结果显示,24 h时,LV-sh LMTK3组细胞和LV-Control组细胞间的增殖速度无明显差异(P=0.4730);48 h、72 h、96 h和120 h时,LV-sh LMTK3组细胞的增殖速度均明显低于LV-Control组细胞的增殖速度(分别为P=0.0084,P=0.0005,P=0.0005和P=0.0006);LV-sh LMTK3组细胞的克隆形成数明显少于LV-Control组细胞的克隆形成数(P=0.0032);划痕实验结果显示,细胞培养48 h时,LV-sh LMTK3组细胞的迁移能力明显低于LV-Control组细胞的迁移能力(P=0.0038),Transwell迁移实验结果与划痕实验结果一致(P=0.0010);Transwell侵袭实验结果显示,细胞培养48 h时,LV-sh LMTK3组细胞的侵袭能力明显低于LV-Control组细胞的侵袭能力(P=0.0055);流式细胞术结果显示,细胞培养48h时,LV-sh LMTK3组细胞的凋亡率明显高于LV-Control组细胞的凋亡率(P=0.0078);4.LMTK3基因沉默慢病毒载体感染BCPAP细胞后,BCPAP细胞的形态变化不明显,LV-sh LMTK3组ERα、CDK6、E-cadherin、Twist、MEK、PKC m RNA的表达量均显著高于LV-Control组(分别为P=0.0033,P=0.0389,P=0.0151,P=0.0251,P=0.0050和P=0.0049),LV-sh LMTK3组LMTK3、ERβ、AR、N-cadherin、Vimentin、Snail2、MMP-2、MMP-9、ERK、TGF-β1、Bcl2、Capsase3 m RNA的表达量均显著低于LV-Control组(分别为P=0.0008,P<0.0001,P=0.0288,P=0.0005,P<0.0001,P=0.0480,P=0.0221,P=0.0239,P=0.0463,P=0.0197,P=0.0008和P=0.0044),而CDK2、CDK3、CDK4、MMP-3、Bax、Snail1和AKT m RNA在两组中的差异无统计学意义(分别为P=0.2159,P=0.3582,P=0.9184,P=0.0880,P=0.8941,P=0.1508和P=0.1554);5.LMTK3基因沉默慢病毒载体感染BCPAP细胞后,ERα蛋白表达量显著高于LV-Control组(P=0.0005);ERβ、p-ERK1/2、p-AKT和β-catenin的蛋白表达量显著低于LV-Control组(分别为P=0.0021,P=0.0006,P=0.0033和P=0.0009),而总的ERK1/2和AKT的蛋白表达水平没有明显变化(分别为P=0.0986和P=0.6428)。结论:1.LMTK3基因沉默可以显著抑制BCPAP细胞的增殖和侵袭转移能力,并能促进其凋亡。2.雌激素受体、PI3K/AKT、MEK/ERK、TGF-β1、Wnt/β-catenin等信号通路和EMT进程均参与了LMTK3对BCPAP细胞增殖、侵袭转移和凋亡的调控。