成体心脏内存在具有特异性心肌分化潜能的多能干细胞,是存在于发育成熟机体心脏组织中的具有高度自我更新和特异性心肌分化、增殖潜能的未分化细胞,缺血性心脏病引起的心肌损伤不能通过自身再生来修复,因此挽救梗死的心肌组织,恢复其原有的功能是治疗缺血性心脏病的关键。骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）是常见的"种子细胞",具有多方向诱导分化功能,利用这一特性,在一定条件的诱导下就可以向成脂肪、骨、肌肉、神经、心肌、内皮等多类细胞组织的分化。此外,BMSCs还能有效地延缓衰老和修复疾病损伤的组织及器官。将诱导分化为心肌细胞样细胞的骨髓间充质干细胞植入受损的心肌组织,对修复心肌损伤具有一定的作用。随着转基因技术的不断发展,通过基因转染的方式改造干细胞已成为干细胞研究领域的热点。在转基因及基因修饰中,慢病毒载体是应用最广泛的基因载体,与质粒、腺病毒等载体相比,它具有转染效率高、细胞毒性低、目的基因表达时间长等优势。因此,本论文主要以慢病毒为载体,介导基因的转化BMSCs及向心肌细胞分化的研究,研究内容包括以下三部分:第一部分:SD大鼠骨髓间充质干细胞的分离、纯化及鉴定目的:骨髓间充质干细胞（BMSCs）是一种多能干细胞,常被广泛应用于创伤缺损、组织工程研究及组织修复等领域研究。BMSCs具有自我更新复制、多向分化的潜能以及自体移植无免疫排斥等优点,同时BMSCs取材简便、易于体外分离培养与扩增,是广泛研究的“种子细胞”。然而,BMSCs并不如肿瘤细胞系一样能无限繁殖传代,因此在研究和应用BMSCs时,必须要将BMSCs从供体中提取、分离出来,在体外经过扩大培养、纯化及鉴定后方可用于后续的实验研究。目前关于BMSCs的分离方法主要有四种:全骨髓贴壁分离筛选法、梯度密度离心法、流式细胞仪和免疫磁珠法等。贴壁分离筛选法操作简便,无需精密设备辅助,且对细胞的损伤相对较小,是较为经典的分离方法。因此,本研究采用贴壁分离筛选法分离BMSCs。对分离、纯化后的BMSCs首先进行观察鉴定,通过倒置相差显微镜观察培养细胞的生长特点;其次通过流式细胞术检测细胞表面分子CD29、CD90以及CD45的特有分子表达情况;最后进行体外诱导细胞,鉴定其多向分化能力。方法:本研究采用全骨髓贴壁分离筛选BMSCs,以3周龄清洁级SD大鼠的长骨骨髓为供试体,贴壁筛选分离、提取大鼠的BMSCs,体外扩增培养、纯化,通过倒置相差显微镜观察培养细胞的生长特点是否具有BMSCs特性;通过流式细胞术分析细胞表面是否有CD29、CD90以及CD45分子的表达。结果:1.显微镜观察细胞形态变化特征:最初接种至培养瓶中的细胞呈悬浮状态,细胞呈大小均一的圆球形,数目较多,培养12 h后,有部分细胞开始贴壁生长,大约1-2 d细胞全部贴壁且为圆形,4 d后圆形细胞逐渐转变为不规则形细胞,部分细胞出现长短不均一的突起,此时核清晰可见饱满的细胞核多居中,1周后,细胞进一步伸展,多数细胞形似成纤维细胞。经过传代后细胞生长速度变快,长势良好,形态及排列为有规则的、均一的长梭形。2.流式细胞术分析细胞表面结果:经过流式细胞术检测造血干细胞标志CD45的阳性率为8.7%,细胞纤维连接受体CD29表达量高达96%、细胞黏附分子CD90的阳性率高达93.7%。这一结果说明本研究所分离、培养的细胞,经传代纯化后表面抗原的高表达,符合BMSCs的特征,证明我们所分离培养的细胞为BMSCs。结论:通过显微镜观察和流式细胞术的检测,采用全骨髓贴壁分离筛选法成功分离、培养及扩增BMSCs。第二部分:Wnt11和BMP2过表达慢病毒载体的构建及滴度检测目的:生物技术及基因工程的不断发展,使转基因技术广泛应用于动植物研究中。通过转基因来改造干细胞,使其向特定方向分化,成为干细胞移植领域的研究热点。大量研究证明,慢病毒能作为载体把目的基因整合到宿主染色质中,并能达到稳定遗传效果。利用慢病毒构建基因载体,转染骨髓间充质干细胞,并不影响骨髓间充质干细胞的表型,却有助于干细胞的分化。因此,构建目的基因过表达的骨髓间充质干细胞也是提高干细胞有效分化的一种手段。基于此特点,本研究构建BMP2基因和Wnt11基因的过表达质粒慢病毒载体的骨髓间充质干细胞,制作新型干细胞“基因种子”。基于Wnt11和BMP2重组慢病毒转染骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化的研究基础与设想,紧跟国内外在骨髓间充质干细胞向心肌细胞诱导方面的进展,我们构建慢病毒介导的Wnt11和BMP2表达载体,单转染或双转染骨髓间充质干细胞,比较其诱导向心肌样细胞分化效率,转基因改造优化骨髓间充质干细胞的体外诱导,作为一种新的干细胞诱导方式备受研究者青睐。方法:根据Wnt11和BMP2基因序列扩增目的基因片段,连接到载体中,经过转化、筛选鉴定及测序分析鉴定目的基因序列。采用qRT-PCR实验的扩增,检测慢病毒载体上的WPRE序列,WPRE序列可以随目的基因整合入细胞基因组,根据qRT-PCR的实验数据进行整理换算,即可获得慢病毒液的滴度。结果:1.Wnt11和BMP2基因构建慢病毒pHS-AVC-LW-Wnt11和pHS-AVC-LW-BMP2载体,酶切片段与预期分子量大小一致,即载体构建成功。2.将酶切验证正确的载体进行Blast测序分析,测序发现为Wnt11和BMP2基因,测序正确。3.采用qRT-PCR实验的扩增/检测对象为慢病毒载体上的WPRE序列（WPRE序列可以随目的基因整合入细胞基因组）,根据qRT-PCR的实验数据进行整理换算,即可获得慢病毒液的滴度。Wnt11载体的病毒滴度为每毫升病毒上清中含有6.64×108个活性病毒颗粒,BMP2慢病毒载体滴度为2.71×108个活性病毒颗粒,病毒滴度检测合格。结论:1.成功共建了Wnt11和BMP2基因的慢病毒载pHS-AVC-LW-Wnt11,pHS-AVC-LW-BMP2。2.病毒滴度检测合格,可为后续实验的病毒感染提供了基础。第三部分:慢病毒介导Wnt11和BMP2转染大鼠骨髓间充值干细胞目的:基于Wnt11和BMP2重组慢病毒转染骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化的研究拟设计慢病毒介导Wnt11和BMP2双基因转染诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化的研究,骨髓间充质干细胞的体外诱导作为一种新的干细胞诱导方式受到人们的重视。迄今为止很少见到慢病毒介导Wnt11和BMP2双基因转染诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化的研究,结合国内外同行的研究报道,慢病毒介导Wnt11和BMP2双基因转染诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化有助于提高细胞的分化率。因此,本研究利用慢病毒载体将Wnt11和BMP2分别转染到BMSCs中,在将Wnt11和BMP2双转染到BMSCs中,比较Wnt11和BMP2单基因转染和双基因转染向心肌细胞分化效率,获得过表达Wnt11和BMP2的BMSCs,揭示慢病毒介导的转基因BMSCs的生物学特性,探索基因转染是否优于药物直接诱导。期待借此提升细胞的分化效率,为临床通过心肌细胞移植治疗缺血性心脏病提供优良的细胞来源。方法:1.诱导实验分组:根据加入诱导剂的不同分为6组:A组（BMSCs空白对照组）、B组（Wnt11诱导组）、C组（Lenti-Wnt11-2-GFP慢病毒转染组）、D组（Lenti-BMP2-2-GFP慢病毒转染组）、E组（Lenti-对照-GFP慢病毒对照组）、F组（Lenti-Wnt11-2-GFP/Lenti-BMP2-2-GFP双基因慢病毒转染组）,对培养状态良好的第2代BMSCs按照分组进行定向诱导。诱导前必需经过预实验确定最佳BMSCs诱导密度、药物诱导最佳浓度、诱导时间等参数,最后每组诱导72 h后进行换液,更换为不含诱导剂的IMDM培养基继续培养。2.BMSCs诱导分化心肌细胞后的检测及鉴定:采用5方面检测鉴定每组BMSCs向心肌细胞诱导分化效果及效率:（1）免疫细胞化学染色法检测各组细胞心肌相关标记物cTnT、cTnI及Cx43蛋白质的表达。（2）免疫细胞荧光法检测各组细胞心肌细胞标志蛋白质Desmin、Tm表达情况。（3）qRT-PCR技术检测各组细胞GATA-4、Nkx2.5基因的表达情况。（4）Western blot技术检测诱导培养至28d的细胞Desmin、Tm蛋白的表达情况。（5）透射电镜观察各诱导培养至28 d时的BMSCs超微结构。结果:1.显微镜观察慢病毒转染BMSCs后细胞形态学变化:培养1 w的BMSCs,细胞进一步伸展,体积增大,呈现出多样化的形态,血细胞、造血干细胞等在换液、传代的过程中被逐渐清除;无论是药物直接诱导组还是慢病毒转染组,诱导96 h后,BMSCs增殖显著,且细胞形态明显改变,大部分已转变成类长梭形或多边形;4周后观察BMSCs排列具有明显的方向性,相邻细胞间联系紧密,部分细胞形成漩涡样结构,诱导后BMSCs与对照组相比,其数量及形态均发生变化。但是,很明显观察到慢病毒转染细胞后出现了少许悬浮的死细胞,病毒浓度越大,死细胞越多,随着培养时间的增加,死亡细胞数目减少,细胞逐渐恢复活力并开始增殖。在转染96h后,细胞荧光转染率较高,其中,以MOI=150孔的转染效率最高。由于实验原因,双转染Wnt11和BMP2的细胞死细胞很多,几乎没有存活细胞,未得到相关数据,因此,慢病毒的双转染未成功。空白对照组细胞在培养过程中无细胞死亡,未出现荧光,诱导及转染后细胞形态学变化与预期相符,可进行后期实验。2.免疫细胞化学染色观察各组细胞cTnI、cTnT、Cx43的表达情况:诱导4W后,cTnI、cTnT及Cx43在细胞的胞质中呈阳性表达,统计分析显示,慢病毒转染组中标记物的积分光密度（IOD）值最强。BMSCs空白对照组和Lenti-对照-GFP慢病毒转染组)的Cx43和c Tn I呈弱阳性或阴性表达。各诱导组间各标记物的阳性表达存在显著性差异（P<0.05）。3.免疫荧光化学检测Desmin和Tm蛋白质的表达情况:免疫荧光细胞化学检测结果显示,各实验组导4周后,BMSCs细胞核多呈空染,胞质内Desmin和Tm蛋白均有阳性表达,显示为绿色或红色荧光,直接诱导组为绿色荧光,转染组为红色荧光,BMSCs空质粒转染组荧光表达为弱阳性。慢病毒转染组MOI=150 Desmin和Tm蛋白的阳性率最高。经统计学分析,各实验组Desmin和Tm的阳性表达差异均有统计学意义（P<0.05）。4.相对荧光定量PCR检测结果:qRT-PCR实验结果表明,GATA-4、Nkx2.5各组细胞中均有表达。GAPDH作为内参对照,利用相对定量分析判断GATA-4、Nkx2.5基因的表达情况。结果显示:BMSCs空白对照组和慢病毒空质粒转染组的表达水平相近,直接诱导组和慢病毒转染组的表达水平相对较高,且Wnt11和BMP2慢病毒转染组诱导4周后GATA-4、Nkx2.5基因的表达明显增强,随着诱导时间的延长,诱导水平也逐渐增加,GATA-4及Nkx2.5基因的相对表达量在各时间点均高于其他实验组,差异均具有统计学意义（P<0.05）。5.Western blot检测结果:提取诱导4周后的BMSCs空白对照组、Wnt11直接诱导组、Wnt11慢病毒转染组、BMP2慢病毒转染组和慢病毒转染对照组中的去蛋白质,Western blot检测发现Desmin和Tm蛋白质均有表达,诱导组和转染组的蛋白质表达量高于对照组,其中Desmin蛋白质的表达量在转染组中表达最高,诱导组次之。Tm蛋白质的表达量在转染对照组中最低,诱导组较转染组高,诱导组和转染组均高于空白对照组。统计分析,各实验组Desmin的阳性表达差异均有统计学意义（P<0.05）。6.透射电镜检测结果通过透射电镜观察每组分的BMSCs内部结构,发现慢病毒转染诱导后的BMSCs细胞核位于细胞的中央,呈卵圆形;细胞质内明显可见肌丝、粗面内质网、线粒体、核糖体等细胞器;平行排列的肌丝明显多于其他诱导组,这些特点符合心肌细胞发育过程中的结构特征。结论:1.成功构建Wnt11慢病毒载体和BMP2慢病毒载体介导转染诱导大鼠BMSCs细胞。2.Wnt11或BMP2直接药物组可诱导大鼠BMSCs向心肌细胞分化。3.Wnt11慢病毒载体转染可诱导大鼠BMSCs向心肌细胞分化,BMP2慢病毒载体转染可诱导大鼠BMSCs向心肌细胞分化。4.慢病毒介导的转染诱导大鼠BMSCs向心肌样细胞分化的效率优于直接诱导分化,慢病毒介导的转染有利于大鼠BMSCs获得心肌样细胞。