论文部分内容阅读
在自然环境中,当植物受到生物或非生物胁迫时,植物最快的应激反应是活性氧(Reactive Oxygen Species,ROS)的爆发。其中,1O2是植物光合作用过程中的不可避免的副产物,尤其是在叶绿体中认为最主要的ROS种类。然而,过去对1O2研究与其他活性氧相比较少,其原因是由于1O2活性很高、寿命短,而且很难将其同其它种类ROS分离开来。但条件突变体flu被发现后,通过黑暗光照的简单转换可以实现细胞中产生1O2,自此使对1O2单独进行研究成为可能。链格孢菌(Alternaria alternata)是自然界中三大植物致病真菌之一,能产生具有除草活性的毒素—细交链孢菌酮酸(Tenuazonic Acid,TeA),有潜力开发成生物除草剂。TeA主要作用机理是通过与光系统Ⅱ的D1蛋白结合,抑制光系统Ⅱ受体侧QA到QB之间光合电子的传递,引起过能量化,导致叶绿体中活性氧爆发,造成叶绿体结构破坏。前期的研究表明TeA能够激活拟南芥幼苗中1O2信号途径,我们推测链格孢菌也可能通过分泌毒素TeA来激活拟南芥成熟植株中的1O2信号。本论文主要利用链格孢菌野生型New(WT)、缺毒突变体HP001(MU)、突变体结合TeA处理侵染拟南芥野生型(Col-0)成熟植株,探究链格孢菌与拟南芥成熟植株的相互作用过程中TeA的产生与1O2信号、与病害发展的关系。超高液相色谱-质谱(UPLC-MS)检测结果表明野生型菌饼中TeA含量是突变体的4.2倍,并且野生型菌饼侵染后叶片细胞中TeA的浓度高于突变体菌饼侵染后叶片中TeA的量。利用野生型和缺毒突变体链格孢菌菌饼为材料侵染拟南芥Col-0成熟植株活体叶片,荧光定量结果显示,野生型链格孢菌处理后在6·h时1O2标记基因都立即上调在12h达到峰值,而抗病基因在6h基因表达到峰值,野生型链格孢菌处理后的基因上调幅度和速度显著高于突变体处理拟南芥后的上调幅度,添加毒素0.2 μg TeA后突变体链格孢菌侵染拟南芥的1O2标记基因及抗病基因在6 h和12 h的上调幅度和速率显著高于单独突变体链格孢菌和TeA处理拟南芥后基因表达水平。H2O2标记基因的表达水平在四种处理之间没有显著差异且表达量不高,这说明侵染过程中主要是1O2发挥作用。病斑观察结果显示野生型链格孢菌侵染后形成的病斑尺寸明显要大于突变体链格孢菌的病斑,野生型形成的病斑是突变体的19.6倍,添加毒素TeA后突变体链格孢菌侵染拟南芥所形成的病斑是突变体侵染拟南芥形成的病斑的4倍,明显大于突变体侵染拟南芥形成的病斑。48 h时野生型链格孢菌侵染部位的相对电导率是突变体链格孢菌侵染部位相对电导率的6倍,添加TeA后突变体侵染拟南芥部位的相对电导率高于单独突变体链格孢菌侵染部位的相对电导率。结合这些结果表明,链格孢菌诱导拟南芥成熟植株病害过程中,通过产生TeA激活了1O2而不是H2O2信号,进而推动了病害发展。然而,1O2推动病害发展的信号机制仍然不清楚,尤其是1O2 信号与水杨酸(Salicylic acid,SA)和乙烯/茉莉酸(Ethylene/Jasmonicacid,ET/JA)信号是否存在交叉对话也不清楚。激素合成增加是植物应对病原菌侵染的共同反应,是植物对腐生菌攻击产生抗性的基础。一般认为SA信号负责正调控寄生和兼性寄生菌的抗性,ET/JA信号负责正调控腐生菌抗性,SA升高反而增加植物对腐生菌的敏感性。也有报道认为这三个激素信号都能为植物免疫腐生菌做出正面贡献,SA诱导侵染早期抗性,ET/JA负责后期抗性。然而,许多研究表明不同病原菌和植物互作过程中,SA和ET/JA的作用机制非常复杂。本论文通过探究链格孢菌诱导拟南芥成熟植株的过程中SA和JA含量的变化及与细胞死亡的关系,进一步探究1O2信号与SA和JA信号是否存在交叉对话。荧光定量结果显示,野生型和突变体链格孢菌侵染后的SA相关基因表达量水平上升,但明显晚于1O2标记基因上调的时间和幅度。外源添加3-甲水杨酸适应24h后接种野生型链格孢菌侵染拟南芥后的1O2标记基因的上调幅度和速率低于对照,添加3-甲水杨酸后抗病基因及SA相关基因的表达量的上调幅度高于对照。3-甲水杨酸喷洒后野生型链格孢菌侵染拟南芥2天后的病斑大小显著小于对照,对照形成的病斑是其1.5倍。这表明,外源SA处理能够抑制1O2基因表达,但增加了抗病基因的表达水平。因此,我们初步推论,链格孢菌诱导拟南芥病害过程中,能够诱导SA基因水平的表达,但SA会对1O2信号产生拮抗作用,具体的机制还有待进一步研究。同时,我们也发现在野生型和缺毒突变体链格孢菌侵染拟南芥后二者的JA相关基因水平6 h后开始上调12 h达到峰值与1O2标记基因上调趋势相同,野生型链格孢菌处理上调的幅度和速率明显高于突变体链格孢菌处理。添加0.2 μg TeA后突变体链格孢菌侵染拟南芥的JA相关基因在6 h和12 h上调幅度和速率明显高于单独突变体链格孢菌处理拟南芥后基因表达水平。这些结果初步表明,链格孢菌诱导拟南芥病害过程也能够激活JA基因的表达并促进TeA推动病害的发展,但JA与1O2信号的交叉对话机制还不清楚。本研究初步证明了链格孢菌病原体诱导拟南芥成熟植株病害发展过程中,通过产生TeA进入植物细胞激活1O2信号途径推动病害发展,JA信号与1O2信号作用方向相同,SA信号与1O2信号存在拮抗作用。