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重金属镉并不是人类的必需元素,它在自然界中的分布十分广泛。由于现代化工业的发展,暴露到环境中的镉会越来越多。镉主要通过水、土壤或者空气来扩散、传播,接着通过食物链进入人体。镉随着血液进入很多器官中,主要积累于肾脏和肝脏中,其他器官亦有积累,并不容易排出体外。当镉在人体内积累一定程度的时候,会对人体中的肺、肝脏、骨骼、肾脏、心血管、免疫系统甚至遗传系统等造成不同程度的损伤。镉对肾脏损伤已经被广泛研究,但是分子机制还没有被完全揭示。本研究通过二维电泳技术鉴定出镉影响的12个差异蛋白,并用RT-PCR技术和western blot技术进一步验证,同时初步研究了其中两个蛋白功能的变化。 我们选取ICR小鼠为模型,分为同等数目的四组,并用含有0ppm、10ppm、102ppm和103ppm等四种不同浓度镉离子的食物分别喂养对应组别的小鼠,一周后,获取小鼠的肾脏组织,并提取蛋白和RNA,其中选取用102ppm浓度是文献中常用的暴露剂量。 将102ppm浓度镉饲喂的小鼠肾脏蛋白进行二维电泳并进行质谱分析鉴定得到12个差异蛋白,分别为D-乳酸脱氢酶线粒体前体(D-lactatedehydrogenase,mitochondrial precursor,0.86倍),磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(phosphoenolpyruvate carboxykinase,2.8倍),酰基辅酶A合成酶中链家族3(synthetase medium-chain family member3,0.39倍),羧肽酶M20结构域连接蛋白1(carboxypeptidase PM20D1,0.32倍),驱动蛋白轻链4(kinesin light chain4,1.76倍),维生素B6磷酸氧化酶(pyridoxine-5-phosphate oxidase,2.98倍),转铁蛋白(transferrin,0.75倍),蛋白质合成启动因子4A(protein synthesis initiation factor4A,3.31倍),钠氢交换泵调控因子3(Na+/H+exchange regulatory cofactorNHE-RF3,2.19倍),LIM和SH3结构域蛋白1(LIM and SH3 domain protein1,3.53倍),亚硫酸盐氧化酶前体(sulfiteoxidase,mitochondrial precursor,2.5倍),维生素B6激酶(pyridoxal kinase,2.3倍)。然后利用实时荧光定量PCR技术来检测这些肾脏差异蛋白在四种浓度镉离子处理下的基因上表达的情况,发现其中有一个蛋白:羧肽酶M20结构域连接蛋白1(carboxypeptidase PM20D1)的mRNA水平与二维电泳结果中蛋白水平不一致,再通过Western blot技术来验证所有蛋白在不同浓度镉处理下的表达情况,其结果是与二维电泳结果一致的。所以有些蛋白是在转录水平上被镉调控的,而有些则是在蛋白翻译或降解水平上被镉影响。二维电泳结果与Western Blotting结果一致,说明了二维电泳在蛋白研究中具有一定的重要性和准确性。 在这12种蛋白中,我们选取了LASP-1和NHERF3这两种蛋白,在细胞水平上进行进一步的实验,这两个蛋白在细胞水平上变化趋势与组织中一致,添加一定浓度的镉会导致细胞迁移速度加快,这与LASP-1蛋白有着密切关系。选取镉处理的小鼠肾脏组织做免疫组化,可见NHERF3蛋白不仅含量变多,还集中分布于肾脏皮质及肾小管外围,NHERF3蛋白的变化是肾脏功能变化的一个标志之一,因此,镉导致肾脏在结构和功能的早期变化。