机械扰动贯穿于植物生命历程的始终。大量研究证实,自然界中的风吹、雨打和植物组织内部的膨压等机械刺激在植物的生理过程中发挥着关键作用,是影响植物生长发育的重要因素之一。目前,关于植物细胞机械信号感受途径存在两种经典假设,它们分别以“细胞壁-质膜-细胞骨架连续体”和“机械敏感性离子通道(如钙离子通道)”为核心。但是,迄今为止缺乏直接的实验证据来支撑这两种假设。因此,本文在已有研究的基础上,以GFP-FABD2融合蛋白和GFP-MBD融合蛋白标记的转基因拟南芥悬浮细胞为实验材料,借助激光共聚焦显微镜,在单细胞水平对细胞壁与细胞骨架的联系、细胞骨架的应激响应特点以及钙阻断对细胞骨架应激响应的影响等进行了实时观察。本研究为证实细胞壁与细胞骨架的连接提供了直接实验证据,有助于植物力信号转导模型的进一步完善。本文主要研究内容和结论如下:1.建立并优化了GFP-FABD2或GFP-MBD融合蛋白标记的转基因拟南芥悬浮细胞培养体系,使其在形态、生长及活力等方面与野生型细胞无显著差异。并通过检测证明优化培养的转基因悬浮细胞与野生型悬浮细胞对低温、高渗和机械应力刺激的应激响应能力非常相似。2.探讨了细胞壁与细胞骨架的联系机制。源自细胞内外渗透压差的膨压是驱动植物细胞生长的主要动力,而高渗处理诱导的质壁分离是研究细胞壁与原生质结构联系的有效手段。因此,本文主要通过渗透处理作为机械刺激手段。选择性酶解拟南芥悬浮细胞的细胞壁导致细胞的质壁分离率下降,提示细胞壁参与膨压响应。药理学方法分别解聚微丝、微管骨架,发现解聚微丝导致细胞质壁分离率下降,而解聚微管则导致细胞的质壁分离率上升,说明微丝、微管骨架都参与膨压响应但具有不同的作用。为探讨膨压响应中细胞壁-细胞骨架的可能联系,我们又实时观察了选择性酶解对微丝、微管骨架的影响。研究发现,纤维素酶和果胶酶造成微丝骨架荧光强度下降,但对微管骨架无影响,揭示微丝骨架与细胞壁有某种联系,细胞壁酶解后细胞质壁分离率下降可能是因为微丝骨架的解聚。为进一步了解细胞壁-细胞骨架的联系机制,我们使用GRGDS多肽孵育悬浮细胞,这一处理导致了质壁分离率上升,微管解聚荧光斑点,但微丝骨架排布未有明显变化,并且不影响选择性酶解所引发的微丝骨架荧光下降,由此可认为微管与细胞壁的连接中可能涉及RGD受体,但微丝则相反。3.研究了细胞骨架对膨压变化的响应特点。在样品上分别滴加1M、0.55M甘露醇溶液和去离子水,能营造膨压动态变化的三种情况。低熔点琼脂包埋固定悬浮细胞后,通过上述方法改变细胞膨压,我们观察了细胞骨架在膨压变化中响应的特点。结果显示当膨压下降时,微管会弯曲、解聚甚至出现荧光斑点,微丝在质壁分离部位解聚,而在不发生质壁分离的部位其排布模式则发生改变。当膨压迅速上升时,微丝解聚,微管随原生质体膨胀而被拉伸,不仅无解聚现象甚至可以观察到新微管合成。此外,图像分析表明微丝、微管的荧光强度变化也各具规律,能反映出膨压改变的趋势。进一步的IPP软件分析和ABAQUS建模验证了微管排布、细胞形态及膨压产生的细胞壁表面应力具有内在的联系。4.为全面了解植物细胞的膨压响应机制,我们探讨了钙阻断对膨压响应中细胞骨架动态的影响。使用细胞膜钙通道阻断剂氯化镧或内膜钙通道阻断剂钌红预处理悬浮细胞后,细胞的质壁分离率分别提高或降低,说明质膜钙通道、胞内钙通道都参与膨压响应,但作用不同。图像分析显示氯化镧和钌红虽都导致微丝和微管骨架荧光强度增加,但膨压变化时,这两种药物处理细胞的骨架动态特征及细胞骨架荧光强度的变化模式不同,提示外源钙离子和内源钙离子对细胞骨架的影响不同。为进一步探讨钙阻断对细胞骨架的影响机理,我们分别使用微丝稳定剂Phalloidin和微管稳定剂Taxol对细胞进行预处理。结果显示,Phalloidin和Taxol处理细胞的质壁分离率及微丝、微管荧光强度的变化模式与氯化镧处理组相类似,表明氯化镧可能因提高微丝、微管的稳定性而改变细胞的应激响应模式。5.除了膨压,来自外界的机械刺激也在植物生长中扮演重要角色。为此,本文最后探索了两种能在单细胞水平上进行可控应力加载并观察细胞骨架动态的方法。方法一,借助原子力显微镜和共聚焦显微镜的联机平台,在利用原子力显微镜探针对单个植物活细胞定量加载的同时,通过共聚焦显微镜记录细胞骨架的变化,随后借助IPP等软件进行Co-location分析,寻找细胞骨架的动态特征。该平台为探讨引发植物细胞应激响应的机械应力阈值提供了新的技术途径。方法二,首先在包埋有细胞的琼脂薄层上固定一个轻质的聚乙烯空杯,随后将样品置于共聚焦显微镜下,通过向空杯内定量注入比重较大的液体对细胞加压,此时利用共聚焦显微镜记录细胞骨架的动态。该方法能在动态加载的同时观察细胞的动态响应,有助于开展植物细胞的机械应力响应的动力学研究。