研究背景：　　卵巢癌、宫颈癌、子宫内膜癌是女性生殖系统三大最常见的恶性肿瘤，其中我国宫颈癌的发病率较高。目前，手术联合放、化疗的综合治疗方式对宫颈癌的治疗有显著效果，80％的患者对铂/紫杉醇类化疗药物敏感，但不少患者在治疗后一段时间内复发。长期的数据统计发现早期宫颈癌患者的5年生存率高达90%以上，而晚期宫颈癌患者的5年生存率则徘徊在10%-30%。因此，宫颈癌诊断方法的完善及耐药机制的明确显得尤为重要。目前临床存在的宫颈病变患者诊断指标，能指导临床医生对患者分期判断，但是没有诊断患者病情的发展及预测耐药程度的指标。因此寻找评估患者发展程度及耐药能力的分子学标志物，探索宫颈癌耐药的分子学机制以获取有效的治疗靶点是改善宫颈癌患者预后的重要研究课题。　　继miRNA的大量研究后，转录本长度大于200nt的长链非编码RNA（LongnoncodingRNA，LncRNA）在肿瘤中发挥的作用已引起极大关注。生长组织特异转录本5（Growtharrestedspecific5，GAS5）是与肿瘤生长及预后密切相关的LncRNA，该基因的异常低表达与肝癌、乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌、膀胱癌、肾癌等其他众多人类实体肿瘤的进展也有密切关系，扮演抑制肿瘤生长及转移的角色。此外，在一项关于GAS5对与乳腺癌细胞促凋亡因素反应的调控实验提示了，GAS5的过表达能过促进多西他赛、5氟尿嘧啶等化疗药物对乳腺癌细胞的杀伤作用。目前，国内外关于GAS5与宫颈癌的研究甚少，GAS5是否异常表达于宫颈癌组织、是否影响了宫颈癌细胞的生物学行为及耐药性、是否扮演了抑癌基因的角色及其作用机制如何等众多问题尚不清楚，有待进一步探讨。　　第一部分GAS5在宫颈癌中的表达及对宫颈癌细胞生物学功能的影响　　研究目的:　　1、探讨GAS5在宫颈癌组织的表达程度，分析其表达与临床指标的关系；　　2、细胞水平验证GAS5对宫颈癌细胞HeLa、SiHa及CaSki增殖、凋亡、侵袭转移能力的影响；　　3、动物模型进一步验证GAS5表达水平与宫颈癌细胞增殖能力的影响。　　研究方法:　　1、取广州医科大学附属第三医院妇科40例宫颈癌术后患者的癌与癌旁组织，结合组织类型、组织分化程度及患者FIGO分期分析GAS5的表达与各指标的关系。　　2、构建GAS5过表达慢病毒载体，分别感染宫颈癌细胞株，得GAS5稳转细胞株HeLa、SiHa与CaSki；设计GAS5-siRNA以抑制HeLa、SiHa与CaSki细胞GAS5的表达。　　3、生物学功能实验检测通过慢病毒过表达或siRNA抑制改变GAS5表达后，宫颈癌细胞生物学行为的改变。　　1）CCK-8比色法检测细胞生长曲线的改变；　　2）流式细胞术检测过表达GAS5后细胞周期及凋亡的情况；　　3）Transwell迁移及侵袭实验检测细胞迁移、侵袭能力的改变；　　4、构建宫颈癌SiHa细胞裸鼠成瘤模型，观察GAS5稳转株与NC组生长在动物体内的差别。　　5、统计学分析　　应用SPSS19.0软件进行统计学分析，数据结果以??±s表示，两组数据比较采用Fisher确切概率法和Student’st检验，多组数据间比较采用方差分析和LSD检验，检验水准为α＝0.05，P<0.05为差异有统计学意义。　　结果:　　1、GAS5的表达在宫颈癌组织中较癌旁组织要低，且降低程度与分化程度呈正比相关、与FIGO分期呈负相关。　　2、GAS5慢病毒载体感染后有效提高GAS5表达量，GAS5-siRNA能有效抑制GAS5表达。　　3、CCK8结果提示过表达GAS5有效下调宫颈癌细胞株细胞的生长速度；而siRNA下调GAS5表达后细胞的增殖速度上调。　　4、取GAS5稳定表达的SiHa细胞进行凋亡实验检测，相对于对照组而言，细胞的凋亡率上升且细胞大部分停留在G0/G1期。　　5、过表达GAS5能够降低HeLa、SiHa及CaSki细胞的侵袭转移能力，而抑制GAS5能够增强HeLa、SiHa及CaSki细胞的侵袭转移能力。　　6、GAS5能够上调SiHa细胞在裸鼠体内的生长速度，与对照组相比，差异有统计学意义。　　结论:　　1、GAS5在宫颈癌中低表达，且GAS5水平与宫颈癌分期及组织类型有相关性，或许能作为临床诊断或治疗指标。　　2、作为抑癌基因，GAS5能够在细胞水平上抑制细胞的增殖及侵袭转移，上调细胞的凋亡率。　　3、GAS5在动物模型中亦能抑制SiHa细胞的增殖能力。　　第二部分GAS5对宫颈癌SiHa及SiHa/cDDP细胞顺铂耐药性的影响　　研究目的:　　1、构建SiHa细胞的顺铂耐药细胞株SiHa/cDDP；　　2、验证GAS5及miR-21表达对SiHa及SiHa/cDDP顺铂耐药性的影响。　　研究方法:　　1、逐步增加宫颈癌SiHa细胞培养液中顺铂的浓度从而诱导SiHa细胞产生耐药　　性，建立SiHa细胞耐顺铂细胞系。顺铂起始浓度为0.1μg/mL，逐渐递增，待细胞能在此浓度稳定生长时，再进行下一个较高浓度的诱导。历时8个月构建SiHa顺铂耐药细胞SiHa/cDDP。　　2、GAS5慢病毒载体感染SiHa及SiHa/cDDP细胞，构建GAS5稳定表达的SiHa及SiHa/cDDP细胞。设计GAS5-siRNA、miR-21mimic及miR-21inhibitor处理SiHa与SiHa/cDDP细胞。　　3、改变GAS5与miR-21表达水平后观察SiHa细胞与SiHa/cDDP细胞顺铂敏感性的改变。用不同浓度梯度的顺铂（1、2、3、4、5、6、10、15和30μg/mL）进行处理两种细胞，CCK8检测吸光度计算出细胞的存活率。　　4、统计学分析　　应用SPSS19.0软件进行统计学分析，数据结果以??±s表示，两组数据比较采用Fisher确切概率法和Student’st检验，多组数据间比较采用方差分析和LSD检验，检验水准为α＝0.05，P<0.05为差异有统计学意义。　　结果:　　1、成功构建SiHa/cDDP细胞（IC50=12.268μg/mL）的耐顺铂能力为SiHa细胞（IC50=2.14μg/mL）的5.7倍。倒置显微镜下可观察到SiHa/cDDP形态教SiHa细胞发生变化，变得更加细长，个别甚至呈现状。　　2、GAS5慢病毒载体成功感染SiHa/cDDP细胞后成功上调GAS5的表达水平。3、过表达GAS5及抑制miR-21表达后，SiHa细胞的凋亡率提高；而抑制GAS5及抑制miR-21表达后，SiHa细胞的凋亡率下降了。　　4、过表达GAS5及抑制miR-21表达后，SiHa/cDDP细胞的凋亡率上升，而抑制GAS5及过表达miR-21后，SiHa/cDDP细胞的存活率则上升。　　结论:　　1、GAS5及miR-21对宫颈癌SiHa细胞的顺铂耐药性有调节作用，GAS5能增强顺铂对SiHa细胞的杀伤作用，而miR-21则能降低顺铂对细胞的杀伤作用。　　2、GAS5及miR-21对宫颈癌SiHa/cDDP细胞的顺铂耐药性同样有调节作用，GAS5能增强顺铂对SiHa/cDDP细胞的杀伤作用，而miR-21则能降低顺铂对耐药细胞的杀伤作用。　　第三部分GAS5对宫颈癌细胞生物学活性及顺铂敏感性影响的机制探讨　　研究目的:　　分子水平上进一步论证GAS5通过靶向基因微小RNAmiR-21而调控抑癌基因PTEN及PDCD4的表达发挥抑制宫颈生长、转移及耐顺铂的作用机制。　　研究方法:　　1、过表达或抑制GAS5后检测HeLa、SiHa及CaSki细胞的miR-21表达水平，过表达或抑制miR-21后检测HeLa、SiHa及CaSki细胞的GAS5表达水平，观察二者在细胞水平上的相互调控。　　2、WesternBlot检测GAS5水平的改变对PTEN及PDCD4蛋白表达的影响。　　3、双荧光素酶报告基因证实GAS5及miR-21存在直接调控关系。　　结果:　　1、三种宫颈癌细胞过表达GAS5水平后检测miR-21的表达结果提示miR-21下降，而抑制GAS5表达后miR-21则上调，同样改变miR-21表达水平再检测GAS5表达得到相似结果，提示二者有相互调控关系。　　2、改变GAS5的表达检测PTEN及PDCD4，发现二者有正相关，说明GAS5能够调节PTEN及PDCD4，且呈正向调节。　　3、双荧光素酶报告基因结果提示GAS5与miR-21存在结合位点，二者能直接调控。　　结论：　　1、GAS5与miR-21直接相互调控。　　2、GAS5能通过miR-21调控PTEN及PDCD4发挥抑癌基因作用。　　全文结论　　1、GAS5异常低表达与宫颈癌，表达程度与临床分期呈负相关；GAS5的过表达可以显著抑制宫颈癌细胞HeLa、SiHa及CaSki的增殖、迁移及侵袭能力，增加宫颈癌细胞的凋亡率；而miR-21异常高表达于宫颈癌，表达程度与临床分期呈正相关；miR-21能与GAS5直接结合相互调控，且GAS5或许能够通过miR-21调控PTEN和PDCD4。GAS5或许能够作为一个宫颈癌分期预测的生物指标。　　2、GAS5能够提高顺铂对宫颈癌细胞的杀伤作用，而miR-21能够降低顺铂对宫颈癌细胞的杀伤作用，GAS5或许能够逆转宫颈癌耐药细胞的耐药性。