论文部分内容阅读
近来研究发现,在脑缺血后,再灌注前,反复行数次短暂再灌注/缺血能明显减轻脑的梗死容积,减少再灌注损伤,具有脑保护作用,此现象被称为“缺血后处理”(Ischemic Postconditioning, IPost)。IPost作为减轻脑缺血再灌注损伤的新型干预措施,如何实施才能达到有效脑保护效应,目前仍未可知。线粒体敏感性转化孔(Mitochondrial Permeability Transition Pore, mPTP)是线粒体内、外膜之间的非特异性孔道,在再灌注早期开放,可以诱导细胞的凋亡。心肌IPost的机制研究提示,mPTP在IPost对心肌的保护作用中扮演重要的角色,可能是IPost保护机制的共同通路,然而,mPTP在脑IPost的作用如何,目前仍需进一步的探索和研究。因此,本研究正是利用大鼠中动脉阻闭模型(Middle Cerebral Artery Occlusion, MCAO),探寻和筛选脑IPost保护作用的有效时间,并且以mPTP为切入点,初步探讨脑IPost的保护机制。第一部分脑IPost保护作用的时间方案筛选及与缺血预处理比较方法1.缺血后处理对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤保护作用的时间方案筛选健康雄性SD大鼠60只随机分为6组:对照组(缺血90min)和IPost不同时间点组(缺血90min后,分别在15s/30s/1min/2min/5min进行再灌注/缺血处理,反复三次)。所有动物再灌注24h行神经功能障碍评分。24h后处死动物,TTC染色以确定梗死容积。2.缺血后处理与缺血预处理脑保护效应的比较30只SD大鼠随机分为3组:对照组,IPost组和缺血预处理组(Ischemic Pretconditioning, IPC)组(缺血20min,再灌注24h后行MCAO 90min)。所有动物再灌注24h行神经功能障碍评分。24h处死动物,TTC染色确定梗死容积。结果术后所有动物都存活。缺血再灌注后大鼠均表现一定的神经功能障碍。1.缺血再灌注24h后,IPost-15s/30s/1min/2min组神经功能障碍评分与对照组相比显著降低,尤以IPost-15s组低于其它各组,而IPost-5min组与对照组相比较无统计学意义。再灌注24h脑梗死容积百分比:IPost-15s组,IPost-30s组,IPost-1min组和IPost-2min组分别明显小于对照组,而IPost-5min组与对照组相比较差异无统计学意义。IPost-15s组脑梗死容积显著小于其它各组。最后确定IPost-15s组做为后续实验时间。2. IPost组和IPC组神经功能障碍评分显著低于对照组。IPost组和IPC组脑梗死容积小于对照组。但IPost组脑梗死容积大于IPC组。第二部分mPTP在脑缺血后处理保护机制中的作用研究方法1.mPTP开放剂苍术苷最低有效剂量的筛选再灌注前10min侧脑室注射不同浓度的mPTP开放剂苍术苷(Atractyloside, Atr),以确定可以促使mPTP开放的最低有效剂量。30只SD大鼠随机分为3组:对照组,Atr-1组(4mmol/L,15μl),Atr-2组(2mmol/L,15μl);再灌注24h行Garcia神经功能行为学评分。24h后处死动物,TTC染色以确定梗死容积。2.在体实验确定mPTP在脑缺血后处理保护效应中的作用利用侧脑室注射mPTP的关闭剂环孢菌素A(Cyclosporin A, CsA)和开放剂Atr来确定mPTP在脑IPost保护中的作用。70只SD大鼠随机分为7组。溶剂组(100%乙醇),对照组,对照组+CsA(2μmol/L,15μl再灌注前10min给予),对照组+Atr(再灌注前15min给予);IPost组,IPost+CsA(2μmol/L,15μl再灌注前10min给予),IPost+Atr(再灌注前15min给予)。所有动物分别再灌注24h、48h和72h行Garcia神经功能行为学评分。72h后处死动物,TTC染色确定脑梗死容积。3.透射电镜下观察脑缺血后处理保护效应中线粒体的超微结构实验分组同实验2,待模型制作成功后,再灌注72h后取损伤侧海马组织,通过透射电镜观察脑组织线粒体的超微结构。4.离体实验近一步证实mPTP在脑缺血后处理保护效应中的作用利用分光光度计检测mPTP开放和关闭的程度。70只SD大鼠随机分为7组。90min单纯缺血组,其余分组同实验2。所有动物于再灌注15min后提取线粒体,利用分光光度计在520nm波长下所测得吸光度值来检测mPTP开放和关闭的程度。结果1.缺血再灌注24h后,Atr-1组神经功能行为学评分与对照组相比有显著统计学差异。Atr-2组神经功能行为学评分显著大于Atr-1组。再灌注24h脑梗死容积百分比:Atr-1组明显大于对照组,而Atr-2组脑梗死容积百分比显著低于Atr-1组。最后确定Atr为2mmol/L,15μl作为后续实验剂量。2.在再灌注的各个时间点中,对照组+CsA和IPost组神经功能行为学评分显著高于对照组。IPost+Atr神经功能行为学评分与IPost组相比具有统计学意义。而IPost+CsA神经功能行为学评分与IPost组相比无统计学意义。再灌注72h后,对照组+CsA和IPost组的脑梗死容积显著低于对照组。IPost+Atr脑梗死容积显著大于IPost组。而IPost+CsA脑梗死容积与IPost组相比无统计学意义。对照组和溶剂组之间无统计学差异。3.通过透射电镜可以观察到正常线粒体呈杆状,结构完整,外膜平滑光整,线粒体嵴排列整齐,并且清晰可见;对照组和加入Atr组的线粒体结构破坏严重,线粒体肿胀,线粒体嵴消失,内部空泡化。而IPost组和加入CsA组线粒体的内部结构基本完整,线粒体嵴排列整齐,线粒体膜清晰可见。4.与单纯缺血组相比,其它各组吸光度的改变值明显升高;加入CsA组的吸光度改变值明显低于对照组;加入Atr组的吸光度改变值明显高于IPost组。但IPost+CsA与IPost组相比,吸光度的改变值无统计学意义。结论1.缺血后处理对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的保护作用时间为15s再灌注/缺血,反复三次。缺血后处理的脑保护效应略弱于缺血预处理。2.脑缺血后处理可以抑制脑的缺血再灌注损伤,改善线粒体的结构和功能,最终起到脑的保护作用。3.脑缺血后处理的部分机制可能是通过再灌注早期抑制线粒体通透性转化孔的开放,改善了线粒体的结构和功能,最终起到脑的保护作用。