目的：大块骨损伤是目前重建手术的巨大挑战。目前,临床上常用的治疗方法包括自体骨移植,异体骨移植和人工材料单独或结合骨移植。然而,自体骨移植材料来源有限且可导致供体损伤。异体骨移植有导致免疫反应、疾病传播和炎症的风险。近年来组织工程骨技术治疗骨缺损的研究吸引了人们的注意。组织工程骨技术有三个关键元素：(1)细胞(2)生长因子(3)支架。同时,组织工程骨的生长环境对成骨也有很大的影响。骨髓间充质干细胞是一种可以分化为成骨细胞,脂肪细胞,肌腱细胞和骨髓细胞的多能干细胞。骨髓间充质干细胞可以在骨髓提取并在体外迅速扩增,因此被广泛用做种子细胞。富血小板血浆富含可以影响骨再生的生长因子。当被激动剂例如凝血酶激活时,富血小板血浆可以释放这些细胞因子。支架材料在组织工程骨技术中有关键性的作用,β—磷酸三钙生物支架材料具有高生物相容性,良好的生物可吸收性和可诱导成骨细胞分化增殖等优点。灌注型生物反应器可以模拟生物内环境和创建一个三维立体空间,来促进细胞的粘附、增殖和分化。成骨分化早期的重要参考指数为ALP的表达水平。此外,ALP在骨的钙化过程中起着十分重要的作用,常被认为是成熟的成骨细胞的标志性酶。在体外成骨试验中,ALP浓度的定量检测常被用作早期成骨份化的常规性标志物。Bglap2作为成骨细胞成熟的标志物,主要在骨细胞钙化期出现。本实验应用灌注型生物反应器,利用骨髓间充质干细胞和β—磷酸三钙生物材料支架在体外构建组织工程骨,并利用富血小板血浆作为成骨诱导中生长因子的来源,将以上因素相互组合成不同实验组和对照组,植入兔皮下,通过检测不同组合构建的复合体其ALP和Bglap2的表达水平,评估以上各因素在组织工程骨成骨中的促进作用。方法1.取2-3月龄的健康的新西兰大白兔,麻醉好后放于实验台,备皮,固定,消毒,铺无菌巾,在无菌条件下用穿刺针抽取双侧胫骨平台内下侧骨髓5ml,梯度密度离心法结合贴壁培养法提取骨髓间充质干细胞,进行原代、传代细胞培养。流式细胞仪鉴定。2.制备富血小板血浆。经兔耳缘静脉抽取新鲜血液约5ml,在无菌条件下,迅速加入到盛有1ml 5%枸橼酸钠的10ml离心管中,轻轻摇晃,防止凝固。将上述离心管中的血液放入离心机中,采用二次离心法制备富血小板血浆,第一次离心3300rpm,第二次离心3000rpm,然后得到无色透明的胶冻状物质即是富血小板血浆。3.将第三代兔骨髓间充质干细胞制备成细胞悬液,将制备的细胞悬液滴加到β—磷酸三钙支架材料上,上下翻转支架材料,这样可以使支架材料的每部分都有细胞接触,滴加好细胞悬液后,向每个培养孔板中追加3ml的细胞培养基,放入37℃、5%CO2培养箱中进行培养,过夜。将上述制备的骨髓间充质干细胞与β—磷酸三钙(β-TCP)支架复合体置入含有或不含有富血小板血浆的生物反应器灌注柱内,最后,将生物反应器整套系统置入37℃、5%CO2孵箱培养3周。放置好后调节流速为3ml/min,没2-3天换一次培养液。电镜下观察生物支架及骨髓间充质干细胞的粘附、增殖和生长。我们将构建的兔骨髓间充质干细胞复合支架材料分成五组：A组：富血小板血浆+骨髓间充质干细胞+β-磷酸三钙+生物反应器B组：富血小板血浆+骨髓间充质干细胞+β-磷酸三钙C组：骨髓间充质干细胞+β-磷酸三钙+生物反应器D组：骨髓间充质干细胞+β—磷酸三钙E组：β—磷酸三钙。4.将在生物反应器中培养的复合体取出,植入到大白兔腰部的深浅筋膜之间,缝合,并记录其位置,三个月以后,处死大白兔取出复合体材料,将复合体材料上的细胞分离并进行定量PCR以检测细胞中骨钙素和碱性磷酸酶的表达。5.定量PCR重复三次。所得计量数据用均数±标准差(x±s)表示,数据使用SPSS18.0统计学软件进行各组之间的单因素方差分析或t检验,P<0.05被认为具有统计学意义。结果1.使用倒置相差显微镜镜下观察骨髓间充质干细胞可见接种后3天出现少量细胞粘附贴壁,此时细胞呈现梭形。培养7天后观察到细胞集落的出现,传代培养7天后观察到细胞形成漩涡状集落。2.使用流式细胞仪对经过2次传代后的骨髓间充质干细胞进行鉴定,结果示2%的细胞为CD34阳性,98%的细胞为CD44阳性。3.电镜下可见骨髓间充质干细胞在三维支架材料上良好的粘附和分布。4.实验组因骨钙素2(BGLAP2)、碱性磷酸酶(ALP)基因的表达明显高于其他组。实验组之间的比较也表现出统计学意义。结论1.骨髓间充质干细胞是组织工程中较理想的种子细胞。2.自体富血小板血浆能够有效诱导成骨。3.骨髓间充质干细胞适合于在β—磷酸三钙(β-TCP)支架材料上黏附和增殖。4.生物反应器可以提供促进骨髓间充质干细胞粘附、生长和分化的三维立体环境从而促进骨的生成。