研究背景随着我国社会经济的变革,城市化、工业化和全球化导致人们生活方式的改变,心血管疾病的危险因素明显增多,心血管疾病呈爆发性增长,其中,心肌梗死成为全世界人类死亡的主要原因之一,尽管目前运用许多措施来治疗心肌梗死,但无法从根本上修复已损坏的心肌。近年来,利用干细胞移植来治疗心肌梗死得到了科学家们的关注,因此,干细胞作为人类心肌细胞的再生资源,具有广阔的应用前景。P19CL6细胞是多能的小鼠畸胎瘤细胞,在含1%DMSO的培养基中培养时,能高效分化为节律性跳动的心肌细胞,因此,本课题利用这一模型展开对体外心肌分化的研究。过氧化物酶体增殖物受体α(PPARα)作为核受体家族成员之一,是贝特类降血脂药的分子靶点,它可以通过调节能量代谢中关键基因的表达,来调节脂肪酸的摄取、酯化和氧化。GATA家族是一类具有锌指结构的转录因子,其中Gata-6负责调节胚胎形态发生和心肌特异性分化,并且已被公认为是心脏发育中的必需基因。本课题组已有研究证明,Gata-6能够招募PPARα到葡萄糖转运蛋白Glut4上,从而调节心肌能量代谢,而心肌分化与能量代谢密切相关,那么,Gata-6与PPARα对心肌分化有何影响呢?为了回答此问题,我们从PPARα的配体非诺贝特(fenofibrate)和拮抗剂GW6471入手,初步探究其对P19CL6向心肌分化的影响,由此进一步研究PPARα对心肌分化的影响,以及与Gata-6形成蛋白复合体后对心肌分化的影响。结果表明,Gata-6能促进P19CL6向心肌细胞分化,PPARα在P19CL6细胞中过表达后对心肌分化没有明显的影响,而P19CL6细胞共表达PPARα和Gata-6时,对细胞分化的协同促进作用并不明显,甚至抑制了P19CL6向心肌细胞的分化。有趣的是,瞬时转染PPARα和Gata-6对心肌分化标志基因α-MHC启动子活性有明显的协同激活作用。鉴于此,我们推测,在PPARα与Gata-6相互作用的过程中,是否招募了其他辅助抑制因子,从而影响了PPARα与Gata-6对P19CL6向心肌分化的促进作用。考虑到Polycomb家族蛋白(PcG)是一组抑制基因转录的蛋白,我们设想,是否Polycomb蛋白涉及此过程?文献检索发现,Gata-4蛋白第299位赖氨酸可被PcG成员EZH2甲基化,从而转录活性被抑制,此外,Gata-4还可通过招募Polycomb家族蛋白从而影响肿瘤细胞的增殖和分化。那么,基于同一家族成员蛋白分子之间结构和功能方面的相似性,我们推测:PcG可能与PPARα与Gata-6相互作用,从而抑制P19CL6细胞向心肌分化,为此,我们展开了本课题的研究。研究目的本研究旨在探讨Polycomb家族蛋白与Gata-6、PPARα相互作用对P19CL6细胞向心肌分化的影响,此结果将对干细胞移植以及心肌梗死的治疗具有重要意义。研究方法1.在诱导P19CL6细胞向心肌分化,使用不同浓度的PPARα激动剂fenofibrate、拮抗剂GW6471或者去氧肾上腺素处理2天或6天,收取核蛋白和RNA样品,进行western blotting以及q PCR检测心肌标志基因α-MHC的表达。2.过表达或者抑制PPARα和Gata-6在P19CL6细胞中的表达,诱导其向心肌分化,western blotting检测α-MHC的表达。3.将PPARα和Gata-6的不同结构域转染至P19CL6细胞,研究PPARα和Gata-6相互作用结构域对心肌分化的作用。4.使用磷酸钙转染法,将PcG、PPARα和Gata-6连同带有α-MHC启动子的荧光素酶报告基因质粒转染至P19CL6细胞中,36h后收集细胞,检测荧光素酶的活性。5.用1%DMSO诱导P19CL6细胞分化为心肌细胞,并进行western blotting检测EZH2、Bmi1、Ring1B、PPARα和Gata-6的表达情况。6.使用脂质体转染法,将PPARα和Gata-6分别或共同与EZH2、Ri-EZH2、Bmi1、Ri-Bmi1共转染至P19CL6细胞中,并且用G418筛选2周,得到稳定表达或抑制相应基因的细胞株,进行western blotting验证上述基因的表达;而后使用1%DMSO诱导稳定转染的细胞株分化为心肌细胞,收取细胞,提取核蛋白,通过western blotting检测α-MHC蛋白的表达情况。7.收取未分化和已分化的P19CL6细胞,进行Ch IP实验,用与PcG、PPARα和Gata-6以及相关表观遗传修饰蛋白的抗体IP,并经纯化柱纯化得到DNA片段,而后进行q PCR,检测这些蛋白的富集情况。8.收取诱导分化的P19CL6细胞,提取核蛋白,进行Co-IP实验,分别加入PPARα和Gata-6的抗体IP,所得的蛋白进行western blotting,检测EZH2、Bmi1、Ring1B是否与之存在相互作用。研究结果1.药物处理P19CL6细胞后诱导分化结果如下:(1)PPARα的激动剂fenofibrate对P19CL6向心肌分化的影响具有一定的剂量依赖性和时间依赖性,随着fenofibrate作用剂量的增大以及作用持续时间的延长,心肌分化标志基因α-MHC蛋白出现的时间由诱导第12天延长至18天以上,去氧肾上腺素与fenofibrate共同作用于P19CL6细胞,可抑制其向心肌分化。(2)PPARα的拮抗剂GW6471对P19CL6细胞向心肌分化的影响同样具有一定的剂量依赖性和时间依赖性,但是与fenofibrate的作用趋势相反,随着作用剂量的增大以及作用持续时间的延长,α-MHC蛋白出现的时间由诱导第16天提前至第12天,去氧肾上腺素可以与GW6471协同促进P19CL6细胞的分化。2.过表达PPARα对P19CL6向心肌分化没有明显的促进或者抑制作用,但是抑制PPARα可以延滞心肌分化。过表达Gata-6可以将α-MHC蛋白表达的时间提前至诱导的第14天,而抑制Gata-6的表达后,P19CL6细胞在18天内都没有出现α-MHC的表达。3.Gata-6、PPARα具有协同作用,并且抑制了P19CL6向心肌分化,但是Gata-6、PPARα两者不同的结构域相互作用,对P19CL6向心肌分化产生了不同的作用,或促进,或抑制,说明Gata-6、PPARα对心肌分化的影响机制可能与其结构域有关。4.Luciferase检测α-MHC启动子活性实验结果如下:(1)单独转染Gata-6、PPARα的P19CL6细胞,α-MHC启动子被显著激活,而共转染Gata-6和PPARα,α-MHC启动子活性与对照组相比升高了10倍以上,并显著高于单独转染组。(2)PcG与Gata-6、PPARα共转染组,α-MHC启动子与对照组相比没有明显激活,说明PcG可抑制Gata-6、PPARα对α-MHC启动子的激活作用。5.诱导P19CL6细胞向心肌分化,第12天表达α-MHC蛋白,PPARα、Gata-6蛋白则始终表达,EZH2、Bmi1随分化进程表达升高,Ring1B随分化进程表达则降低。PcG蛋白表达的动态变化,表明其可能在心肌分化过程中产生特定的调控作用。6.稳转PPARα、Gata-6、EZH2、Ri-EZH2、Bmi1以及Ri-Bmi1的12种细胞株,诱导其向心肌分化,只有Gata-6+Ri-EZH2、Gata-6+PPARα+Ri-EZH2两种细胞株在16天出现α-MHC表达,其余均未观察到α-MHC,说明PcG的过表达或敲低均对P19CL6细胞的分化有影响。7.Ch IP-q PCR结果显示,除PPARα外,与分化前相比,Gata-6、EZH2、Bmi1、Ring1B、H3K9me3、H3K27me3、HP1α、HP1β、HP1γ均在α-MHC启动子区富集显著增多。8.Co-IP结果显示,PcG蛋白与PPARα、Gata-6均能相互结合,说明EZH2、Bmi1、Ring1B确实是通过与PPARα、Gata-6相互结合,从而发挥调控P19CL6向心肌分化的作用。结论1.EZH2、Bmi1、Ring1B分别单独或共同作用于P19CL6细胞,均抑制Gata-6、PPARα对α-MHC启动子的激活作用;2.过表达或敲低PcG蛋白,抑制由于过表达Gata-6、PPARα或Gata-6+PPARα而诱导的心肌分化,尤其过表达PcG后,对P19CL6向心肌分化的抑制作用更加明显;3.PcG蛋白和H3K9me3、H3K27me3在α-MHC启动子区富集,以及PcG通过结合Gata-6及PPARα形成蛋白复合体,最终抑制P19CL6向心肌细胞的分化。