目的：原发性肝癌是严重威胁人类健康的恶性肿瘤,在世界范围内,其发病率在常见肿瘤中排在第六位,而其致死率则位于第三位,仅次于胃癌和食管癌,每年都有超过50,0000的新发病例1。原发性肝癌按照病理分型可以分为肝细胞肝癌、胆管细胞癌和混合性肝癌,其中肝细胞肝癌占到其中的90%。原发性肝癌的主要致病因素包括病毒性肝炎、肝硬化、食用黄曲霉毒素B或亚硝胺等,其中病毒性肝炎引起肝硬化进一步发展为肝癌被认为是肝癌发生、发展中的一个经典过程。由于诊断水平的限制以及缺乏健康查体的意识,有2/3的患者在做出临床诊断时已经处于中晚期,从而失去手术治疗的价值,只能采取以局部消融治疗、肝动脉介入化疗栓塞、局部放疗、靶向治疗+生物疗法等联合的综合疗法2。尽管系统化疗较早地被运用于肝癌的治疗,但是由于肝癌对化疗的敏感性较差,毒副作用比较明显,并且肝癌病人往往合并有严重的肝硬化,正常肝脏功能减退,这使得肝癌化疗的临床应用一直停滞不前。因此寻找到细胞毒性较小的化疗药物并探索出肝癌对化疗药物的耐药机制从而提高肝癌的化疗敏感性在临床工作中具有较为重要的意义。Clusterin (CLU)基因有两种蛋白产物,一个是sCLU(分泌型),另一个是nCLU(核型)。研究发现,sCLU在人体多种肿瘤组织中呈高表达,譬如前列腺癌、肾癌、结直肠癌、膀胱癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌及宫颈癌等345,参与人体的多种生理过程,如免疫调节、细胞粘附、细胞-细胞或细胞-细胞外基质的相互作用、细胞凋亡、DNA损伤、修复等等。最新研究发现,调节sCLU蛋白表达后能够影响前列腺癌、乳腺癌、肾癌等对于各种细胞外刺激(紫杉醇、顺铂、5-氟尿嘧啶等)的治疗敏感性,并认为sCLU蛋白有可能通过打乱Ku70-Bax复合体的正常结构从而抑制了Bax的正常功能使得细胞对治疗措施发生耐药抵抗52；也有研究者对细胞中sCLU分别表达上调和表达下调进行基因表达谱分析后发现众多的NF-kB信号通路中的基因表达有改变,证实了sCLU高表达可以通过调节NF-kB信号通路中的COMMD1和I-kB的表达后促进肿瘤细胞的增殖6。尽管目前的研究证实,sCLU在调节肿瘤的化疗抵抗方法能够发挥一定的作用,但是其在肝癌中的研究还非常有限,本课题组的前期研究发现,sCLU蛋白在多数肝癌组织中呈现高表达,而在癌旁组织中的肝细胞内表达较低,只是在胆管内皮细胞中呈少量表达,这与KANG等的研究结果是相符的53。这也表明,在肝细胞肝癌中,sCLU蛋白也有可能成为干预靶点调节肝癌细胞对于化疗药物的敏感性。本课题组在前期工作基础上,选择sCLU蛋白为靶点,选择应用新型铂类化疗药物-奥沙利铂,拟研究二者联合在肝癌治疗中的作用,并深入探索了sCLU蛋白的具体作用机制,从而为肝癌的靶向治疗以及提高肝癌的化疗敏感性提供了理论和实验依据。方法：选择五种常见的肝癌细胞系—HepG2、Bel7402、Bel7404、SMMC7721、 SNU739,应用Western-blot技术检测细胞中sCLU蛋白的表达情况。设计四条针对clusterin基因的封闭序列,分别将其插入到载体pMAGic7.1的多克隆位点中,得到四个干扰载体(CLU1, CLU2, CLU3, CLU4),经过质粒双酶切后送公司进行测序,验证载体构建是否成功。构建sCLU蛋白的过表达载体,按照NCBI gene bank中的序列,设计引物并用其调取CLU模板cDNA中的序列,PCR扩增后插入到pIRES2-EGFP表达载体中(命名为pIRES2-EGFR/sCLU),测序无误后进一步扩增进行质粒抽提。分别用构建的干扰载体和过表达载体转染筛选出的sCLU蛋白不同表达的肝癌细胞(Bel7402, SMMC7721, Bel7404),应用real-time PCR和Western blot技术检测mRNA和蛋白的表达水平,检测干扰效率和过表达效率,并筛选出封闭效率最强的干扰靶点。分别对Bel7402、SMMC7721、Bel7404三株细胞系应用不同剂量的奥沙利铂处理后用CCK-8法检测细胞的存活率,分析sCLU蛋白封闭表达和过表达后细胞对于奥沙利铂的药物敏感性的变化,利用SPSS软件分析其对药物的IC50,并分析差异。调节三株细胞系中的sCLU蛋白表达后,应用奥沙利铂处理,用流式细胞仪Annexin V+PI双染法检测sCLU蛋白调节前后细胞的凋亡情况,并分析差异。为探索sCLU蛋白的下游信号通路,我们应用前期筛选出的sCLU蛋白有效干扰载体分别转染Bel7402、SMMC7721后,应用SABiosciences RT2Profiler PCR方法检测sCLU蛋白封闭后其下游的凋亡信号通路中相应靶基因的表达情况,筛选有意义的下游靶点(AKT1),应用Western blot技术检测sCLU蛋白封闭表达前后、过表达前后细胞中AKT1蛋白的激活情况,以及下游的凋亡信号通路中Bcl-2、Bax蛋白等的表达情况。为探索出sCLU蛋白与PI3K/Akt信号通路中关键靶点的调节关系,应用Akt特异性抑制剂(TCN)处理细胞,检测二者之间的具体作用关系。为进一步在体内实验中验证sCLU蛋白的作用,我们分别应用Bel7402、Bel7404及其干扰表达和过表达的细胞系进行裸鼠成瘤,两周后开始测定肿瘤的体积,肿瘤体积的评估按照公式：π/6×a2×b进行计算,其中a为肿瘤的短径,b为肿瘤的长径,分组后应用奥沙利铂进行给药,记录肿瘤的生长情况,分析各实验组中瘤体的生长情况。结果：筛选的五种肝癌细胞系中,Bel7402、SMMC7721、HepG2三株细胞系存在sCLU蛋白高表达,而Bel7404和SNU739呈低表达。sCLU蛋白干扰载体和过表达载体经测序后构建成功,转染细胞后应用real-time PCR和Western blot检测sCLU mRNA和蛋白表达,证实干扰效率和过表达效率良好,并分别筛选出稳定的细胞系。CCK-8实验表明,在Bel7402和SMMC7721细胞中封闭sCLU蛋白表达后,细胞经奥沙利铂培养48小时,其IC50由封闭前的54.35uM和40.16uM降低至16.89uM和12.9uM。在Bel7404细胞中过表达sCLU蛋白,经奥沙利铂培养48小时,IC50由过表达前的22uM增高至69uM。而单独干扰sCLU蛋白的表达或者过表达sCLU蛋白,对肿瘤细胞的增殖没有明显的影响。在Bel7402和SMMC7721细胞中,将sCLU蛋白封闭后再应用16uM的奥沙利铂进行处理,与单独sCLU封闭组、单独奥沙利铂药物组相比,细胞存活度明显降低。在Bel7404细胞中,将sCLU蛋白过表达后再应用16uM的奥沙利铂处理,与单独奥沙利铂药物组相比,该组细胞存活度明显增加。流式细胞仪检测细胞凋亡实验表明,封闭sCLU蛋白的表达后再联合应用奥沙利铂能够明显地增加肿瘤细胞的凋亡率,而过表达后再联合应用奥沙利铂其凋亡率降低。应用RT2ProfileTMPCR Array Human Apoptosis检测下游靶点的基因表达变化,以>2倍变化为标准,筛选出4个上调基因(BNIP1、GADD45A、TNFRSF10A、TRADD)和1个下调基因(AKT1),其中以AKT1的变化最为明显。在Bel7402.SMMC7721. Bel7404三株细胞中p-Akt.Akt(?)勺表达无明显差异,而对Bel7402.SMMC721细胞株中sCLU蛋白进行封闭后,p-Akt磷酸化水平明显下调。在Bel7404, Bel7404-OR和Bel7404-sCLUhigh三株细胞中,与对照组Bel7404相比,Bel7404-OR和Bel7404-sCLUhigh中都存在sCLU蛋白的高表达,且p-AKT的水平也有明显增高。应用TCN处理Bel7404-OR和Bel7402细胞后,能够明显抑制P-AKT的磷酸化水平,但是对sCLU蛋白的表达无明显影响。分别检测Bel7402sCLUlow, SMMC7721sCLUlow, Bel7404-sCLU high及其亲本细胞单独或联合应用奥沙利铂处理后对下游Bcl-2家族蛋白的表达影响,应用Western blot技术检测蛋白表达发现,在Bel7402和SMMC7721细胞模型中,OXA处理和sCLU封闭表达都能够上调Bax表达及下调Bcl-2表达,而封闭sCLU表达后再联合应用OXA处理能够更明显地降低Bcl-2/Bax的比率；在Bel7404模型中,单独过表达sCLU对Bcl-2/Bax的比率影响不大,而过表达sCLU后再联合应用OXA处理其Bcl-2/Bax比率比仅应用OXA处理要明显增高。在Bel7404细胞中,通过流式细胞仪检测细胞凋亡发现,单纯应用TCN能够明显增加细胞凋亡率,应用TCN处理后再过表达sCLU,则能够逆转这种现象,同时,过表达sCLU能够增加pAkt的激活并能够逆转由于TCN处理引起Akt蛋白的封闭作用。在Bel7404-sCLUhigh细胞模型中,单独应用TCN处理细胞与单独应用奥沙利铂处理细胞相比,细胞的存活度明显降低。在体内实验中,在Bel7402动物模型中,与对照组相比,OXA处理能够减少肿瘤的体积约为45.1%,但是在对照组和sCLU干扰组之间,肿瘤的体积并没有明显变化,在封闭sCLU蛋白表达后联合应用OXA能够进一步减小肿瘤的体积。而在Bel7404月中瘤模型中,与对照组相比,OXA处理能够减小61.6%的肿瘤体积,同样,在对照组和sCLU过表达组之间肿瘤体积并无明显变化,与单独应用OXA处理相比,sCLU过表达后能够明显增加肿瘤对奥沙利铂的抗药性。结论：1.本研究进一步验证了sCLU蛋白在肝癌中存在高表达,同时也支持了sCLU蛋白在原发性肝癌中是一个具有细胞保护功能的调节靶点；2.在原发性肝癌中,调节sCLU的表达,能够影响肿瘤细胞对奥沙利铂的敏感性；3.调节sCLU蛋白表达后可以影响下游凋亡通路中的蛋白表达,尤其是影响p-AKT的蛋白磷酸化水平,并单向调节线粒体凋亡通路中的关键蛋白发挥化疗增敏的作用；4.在原发性肝癌中,sCLU可以作为干预靶点提高其对化疗药物的敏感性,为肝癌化疗的深入研究提供理论和实验依据。意义：1.在原发性肝癌中研究了sCLU与线粒体凋亡通路中的关键蛋白之间的作用关系；2.研究了sCLU对新型化疗药物奥沙利铂敏感性的调节作用,及产生影响所需的信号通路；3.为sCLU作为新的治疗靶点在原发性肝癌中的进一步应用提供依据。