前列腺癌(prostate cancer，PCa)是欧美男性发病率最高的恶性肿瘤，死亡率居第二位。近年来，随着生活水平的提高和人口老龄化比例的上升，我国PCa的发病率呈逐年上升趋势。尽管PCa患者行内分泌治疗能暂时缓解疾病，但大多数病例最终不可避免地进展为激素非依赖型前列腺癌(hormone-refractory prostate cancer，HRPC)。目前HRPC缺乏有效的治疗，必须寻找新的治疗方法。近来为探索HRPC的有效治疗手段，免疫治疗在国内外备受关注。设计一种免疫治疗策略，产生持久有效的特异性免疫应答，已成为PCa免疫治疗的方向。特别是以树突状细胞(dendritic cells，DCs)为基础的基因免疫治疗已显示出有效的临床治疗前景。 DCs能处理和呈递抗原肽给初始T细胞，从而诱发CD4+辅助性T细胞(helper T cell，Th)和CD8+细胞毒T细胞(Cytotoxic T lymphocyte，CTL)介导的细胞免疫。前列腺特异性膜抗原(prostate specific membrane antigen，PSMA)位于前列腺上皮细胞膜，对于前列腺癌尤其是恶性程度较高、激素治疗不敏感和发生转移的前列腺癌，PSMA是一种有效的基因治疗靶位。用编码主要组织相容性抗原(majior histocompatibility cmplex，MHC)Ⅰ类和Ⅱ类分子的全段PSMA抗原负载DCs不必预先了解患者人类白细胞抗原(human leukocyte antigen，HLA)表型，而且这种多克隆疫苗能够诱发针对多表位的T细胞免疫应答，减少肿瘤免疫逃避的发生。此外，激活HLA II类分子限制性的Th细胞免疫能进一步放大和加强T细胞应答。对于肿瘤的免疫治疗，HLA限制性的CTL提供最佳效果；然而，CTL的产生需要反复刺激，是一个复杂而耗时的过程。而且，在应用DCs疫苗时，因肿瘤患者体内存在复杂的免疫抑制限制了疫苗诱导CTL克隆的大量产生，影响治疗效果，因此联合疫苗和体外诱导的大量特异性免疫效应细胞，将可能更有效地提高抗肿瘤免疫能力。细胞因子诱导的杀伤细胞(Cytokine-induced killer cells，CIKs)是一群具有高增殖活性和非特异性细胞毒性的过继免疫杀伤细胞，这意味同源CIKs能够提供一种可行的治疗方式。CIKs能够被抗原负载的DCs刺激产生MHC限制性细胞毒性，而且两者共培养导致相互活化，提高抗肿瘤免疫反应。本研究中，我们构建携带PSMA基因的复制缺陷型腺病毒，利用重组腺病毒高效转染的特性，转染DCs与同源CIKs共培养，检测共培养细胞表型变化，以及共培养细胞在体外抗前列腺癌细胞的生物学效应。 第一部分 目的：构建携带PSMA基因的复制缺陷型腺病毒载体，并检测其在真核细胞Dul45中的表达。 材料与方法：按人PSMA eDNA序列(编码区序列为262—2514)设计合成一对引物，分别带有HindⅢ和XbaⅠ酶切位点，利用质粒pET-30a—PSMA行PCR扩增；PCR产物和穿梭质粒phdTrack—CMV分别以Hind Ⅲ和XbaI双酶切，纯化后连接，构建重组穿梭质粒pAdTrack—CMV—PSMA；Pmel线性化pAdTrack-ClV-PSIVIA后回收目的基因片段，碱性磷酸酶去磷酸化，再与骨架质粒pAdEasy-1在细菌BJ5183内同源重组得到腺病毒质粒pAd—PSMA；PacI酶切pad—PSMA，脂质体法转染293A细胞包装成复制缺陷型腺病毒Ad—PSMA。将Ad—PSMA体外感染DUl45细胞，Western Blot法检测目的基因表达。 结果：脂质体法将PacI酶切的pAd—PSMA转染293A细胞，24h后荧光显微镜观察到增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的表达，7d后EGFP表达量增加。反复感染293A细胞，最终倍比稀释法测定Ad—PSMA滴度约为1.4×109pfu／ml；Ad—PSMA能有效感染DUl45细胞，转染率约95％，且经Western Blot法可检测到大小约100kD目的蛋白PSMA在DU145中表达。 结论：成功构建了表达PSMA基因的复制缺陷型腺病毒载体，并且在真核细胞中获得高效稳定表达，该结果为进一步研究前列腺癌的生物学特性、转导PSMA基因的DCs疫苗的研制以及开展靶向PSMA的基因免疫治疗提供了实验基础。 第二部份 目的：评价Ad—PSMA转染DCs与CIKs共培养抗前列腺癌细胞的细胞毒活性。 材料与方法：DCs和CIKs分别采用健康人的外周血单个核细胞(PBMC)在不同的细胞因子作用下诱导培养。粘附细胞用含10％人AB型血清的RPMI 1640培养，并补充IL-4，GM—CSF和TNF—α等诱导。非粘附细胞在包被anti—CD3单克隆抗体的培养瓶内，用含IL-2和10％人AB型血清的RPMI1640诱导培养。细胞培养第六天，将Ad—PSMA转染DCs，待其成熟后与同源CIKs共培养-利用流式细胞仪检测DCs和CIKs的表型；胞内细胞因子染色检测胞内INF-γ的产生。乳酸脱氢酶释放实验检测共培养细胞体外杀伤前列腺癌细胞株LNCaP、PC3和DU145的细胞毒活性。 结果：成熟的DCs显示典型的树突状形态和表达相应表型。Ad—PSMA能有效负载DCs，流式检测其转染效率约为70％。流式证实Ad—PSMA转染的DCs与CIKs共培养促进了CD3+CD4+，CD3+CD8+，CD3+CD56+细胞的比例。体外杀伤实验显示，在效靶比为20：1时，共培养的Ad—PSMA—DC—CIKs能显著提高PSMA阳性表达的前列腺癌细胞株LNCaP的杀伤活性，LNCaP细胞裂解率达75％；而不表达PSMA的前列腺癌细胞株PC3和DU145细胞裂解率仅约30％。胞内因子染色证实Ad—PSMA转染的共培养细胞促进了胞内IFN-γ的产生，提高CD8+T(IFN—γ+)细胞的比例。 结论：我们的研究表明，Ad—PSMA转染的DCs与同源CIKs共培养能诱发针对PSMA特异的、强大的抗前列腺癌免疫反应；该研究为临床HRPC提供一种有效的免疫治疗方法奠定了理论依据。