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光调作用（Photobiomodulation,PBM）是指在可见光及红外光谱范围内,通过非光热作用来调节细胞活性的一种生物调节方式。目前应用于PBM较多的光源主要有激光、宽频光源及包括LED在内的发光二极管。PBM可以显著减轻疼痛、炎症从而促进创面愈合,是目前整形外科及皮肤科常用的非手术治疗模式之一。近年有关PBM的生物学功效的研究引起国内外学者的重视,但关于PBM在创面愈合中的具体分子机制的研究国内外尚少。皮肤是人体最大的器官及保护屏障,其损伤后快速有效的愈合对机体维持内环境稳态有着重大意义。表皮干细胞（epidermal stem cells,ESCs）的分化和增殖是创面愈合的基础。最新研究报道,伤口处细胞的细胞因子与生长因子所传递的信息经转录因子整合,从而引发转录反应,可有效促进创面愈合。我们临床上观察到光动力疗法（photodynamic therapy,PDT）作为PBM处理方式之一,对于创面有显著的促愈作用。实验研究中观察到,受损处皮肤的表皮中[Ca2+]的激增,可促使表皮细胞分化,加快伤口愈合。由此,我们有理由推测:如果实现精确调控创缘皮肤细胞内的[Ca2+]升高,可能调控其下游的转录因子的表达,PBM将有利于创面愈合。充分了解[Ca2+]及转录因子在创面愈合中的相关调控机制,从而为临床创面治疗提供新思路。目前文献报道Notch、Jun B,AP-1等多种转录因子参与其中。然而,活化的T淋巴细胞核转录因子（Nuclear factor of activated T cells,NFAT）在创面愈合中的作用及功能未见报道。NFAT是一类转录因子,参与调控细胞周期的演进、生长和分化,特别是在人表皮细胞增殖分化过程中起重要作用。目前研究报道,NFAT转录因子家族有5个亚型,包括NFAT1（NFATc2）、NFAT2（NFATc1）、NFAT3（NFATc4）、NFAT4（NFATc3）、NFAT5,其中1-4亚型转录主要受胞内[Ca2+]调控,NFAT5受渗透压调控。本研究聚焦于NFAT与[Ca2+]在表皮干细胞的增殖分化及创面愈合的作用。有研究观察到伤口部位再上皮化愈合的过程伴随[Ca2+]浓度的升高,认为[Ca2+]是再上皮化启动的最早的信号之一。在非兴奋性细胞中,钙库操作性钙通道（store-operated calciumentry,SOCE）是介导细胞外钙离子进入胞内的重要通道,由胞膜上ORAI1蛋白及内质网上的基质相互作用分子1（stromal interaction molecule 1,STIM1）共同构成。当内质网中Ca2+浓度耗尽时,胞质结构域STIM-CT可直接调节ORAI1蛋白,SOCE通道开放,从而促使Ca2+内流。这提示我们,可以通过调节SOCE通路提升胞内[Ca2+],从而促进NFAT表达。为此,本研究利用光操控SOCE通路(LOVsoc质粒调控[Ca2+]内流开关),通过转染LOVsoc质粒至ESCs及移植转染皮肤中,从离体及在体两个方面探讨光调作用下释放[Ca2+]激活NFAT后,ESCs细胞分化及创面再上皮化愈合中的相关病理生理机制。本研究由三部分组成:第一部分临床光动力疗效的评价研究采用临床上常用的光动力疗法对5名患者难愈性创面进行光调作用,并观察其创面愈合情况,从而明确PBM对创面愈合有着显著的促进作用。我们采用亚甲蓝（Methylene blue,MB）为光敏剂,通过红色发光二极管波长为635 nm,能量为120 J/cm2,100m W/cm2,在垂直距离创面5cm处进行的照射,每周一次,直至创面愈合并达到良好的美容效果。第二部分离体细胞实验探讨相关的调控机制1.1原代表皮干细胞（hp-ESCs）的提取培养及检测从人包皮标本中分离培养hp-ESCs,利用免疫荧光检测表明超过90%的原代ESCs中CK19,Integrinβ1（干性标志物）荧光信号阳性,明确提取的细胞即为干细胞;PCR结果显示,人原代ESCs中NFAT1、NFAT2、NFAT4亚型m RNA均有表达,未见NFAT3亚型m RNA表达。免疫荧光检测人原代ESCs中NFAT不同亚型的表达也得到了相同的结论。1.2通过药物AM404抑制hp-ESCs中NFATs蛋白的表达,明确NFATs对hp-ESCs的增殖分化及迁移能力的影响（1）利用CCK8探究AM404（15um）处理不同时长后对细胞活性的影响,发现AM404处理3天后hp-ESCs细胞活性降低到50%左右。（2）利用Western blot及免疫荧光检测AM404处理hp-ESCs3天（简称AM404组）,NFAT1、NFAT2、NFAT4亚型的蛋白表达被抑制。（3）Ed U细胞增殖实验检测到AM404组荧光阳性细胞数目较多,提示抑制NFATs表达后hp-ESCs细胞的增殖能力上调。（4）Western Blot及免疫荧光检测AM404组细胞分化指标CK10蛋白表达降低,提示抑制NFATs表达后细胞分化能力降低。（5）Transwell小室实验检测细胞的迁移能力,AM404组hp-ESCs穿膜细胞数目显著低于CTL组,提示抑制NFATs表达后细胞迁移能力降低。1.3采用离体培养hp-ESCs,明确转染LOVsoc质粒予以PBM调控后[Ca2+]的变化,并检测hp-ESCs的分化情况（1）转染LOVsoc质粒于hp-ESCs,利用CCK8探究不同PBM时长对细胞活性的影响,选择出最优的光照时长30min。（2）转染LOVsoc质粒于hp-ESCs并予以最佳时长PBM处理细胞（简称PBM光控）,利用FV3000共聚焦显微镜钙成像观察[Ca2+]相对荧光强度,实验组出现生理性的钙震荡波形,表明可PBM光控实现了[Ca2+]的精确调控。（3）PBM光控hp-ESCs,免疫荧光检测hp-ESCs分化指标CK10阳性荧光信号,明确PBM对hp-ESCs有促分化的作用。（4）PBM光控hp-ESCs,Western blot同时检测到细胞分化指标CK10表达上调,免疫荧光检测到hp-ESCs中NFAT1、NFAT2、NFAT4明显入核。第三部分在体实验探讨相关的调控机制（1）运用小鼠制创模型制创,qPCR观察到小鼠创缘皮肤组织在正常修复过程中NFAT不同亚型的m RNA表达情况。（2）转染LOVsoc质粒,观察到PBM处理后小鼠创面愈合率显著提高,明确PBM可通过[Ca2+]活化NFAT对创面有明显的促愈作用。综上所述,PBM可通过调控[Ca2+]/NFAT通路促进hp-ESCs分化及创面愈合。