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本研究克隆得到了凡纳滨对虾的部分免疫相关基因细胞色素C(Cytochrome C,CY3、凋亡诱导因子(Apoptosis-inducing factor,AIF)、自噬蛋白(ATG5)、自噬相关蛋白(Microtubule associated protein1light chain3,LC3)的全长cDNA序列,并利用qPCR技术对上述基因的分子免疫应答特征进行了研究,采用Western Blot技术检测了Caspase3的调控变化,同时检测了WSSV刺后激凡纳滨对虾血细胞中ROS的含量变化,以期为对虾抵御病原侵染的免疫机制提供理论基础。主要结果如下: (1)细胞凋亡相关基因 CYC基因全长582bp,5非翻译区(UTR)为50bp,3UTR为217bp,开放阅读框(ORF)为315bp,编码104个氨基酸,包含一个Cytochrome_C结构域。CYC基因在肌肉、神经、大肠中表达量较高,在皮肤,胃和血液中表达丰度较低。WSSV刺激后,CYC基因和下游凋亡执行因子caspase3基因在肝胰腺和血细胞中均显著上调(P<0.05)。Western Blot结果显示在肝胰腺中CYC的表达未发生明显变化,pro-caspase3和active-caspase3在病毒刺激后均呈现显著上调的变化趋势,在24h时变化最为显著(P<0.05)。 AIF基因全长1664bp,5UTR为154bp,3UTR为187bp,ORF为1323bp,编码440个氨基酸,包含Pyrredox2和AIF C结构域。AIF基因在各组织中均有表达,其中在肠中的表达丰度最高,其次是肌肉;在鳃中的表达丰度最低,其次是神经和血细胞。WSSV刺激后,AIF基因在肝胰腺中表达显著上调(P<0.05),96h后回复到对照组水平;在血细胞中AIF的转录水平有所下降,其中24h和96h与对照组相比差异显著(P<0.05)。 (2)细胞自噬相关基因 ATG5基因全长为1481bp,5UTR为96bp,3UTR为575bp,ORF为810bp,编码269个氨基酸,包含一个APG5结构域。ATG5基因主要在肌肉、皮肤中表达,在鳃中表达丰度最低。在肝胰腺组织中,凡纳滨对虾ATG5基因在病毒刺激24h后,与对照组相比显著上调,在刺激后其他时相与对照组均无明显差异(P<0.05);病原刺激血细胞6h和48h后ATG5基因显著下调(P<0.05),随后回复到对照组水平。此外,通过构建PGEX-4T-2-ATG5原核表达重组质粒,用大肠杆菌系统表达,得到其重组表达产物,发现PGEX-4T-2-ATG5重组蛋白主要在包涵体中进行表达。 LC3基因全长为945bp,5UTR为161bp,3UTR为343bp,ORF为447bp,编码148个氨基酸,包含一个APG12结构域。LC3基因主要在皮肤、大肠中表达,在血液中表达丰度最低。凡纳滨对虾肝胰腺组织经过WSSV刺激后,LC3基因的表达在刺激后48h显著下调(P<0.01);血细胞经过病原刺激后,LC3基因在刺激后6h和48h后显著下调,在刺激后24h LC3回复到对照组水平,而在刺激96h后,显著上调(P<0.05)。 (3)WSSV刺激后,ROS产量在刺激6h后达到最高值(P<0.05),为对照组的1.72倍,随着时间延长逐渐回复到对照组水平。