研究背景和目的结直肠癌(Colorectal carcinoma, CRC)是一种严重危害人类健康的恶性肿瘤。在我国,直肠癌发病率占所有恶性肿瘤的第三位,随着国民生活水平的提高及饮食结构的改变,发生率还有逐年升高趋势。侵袭和转移是结直肠癌治疗失败导致患者死亡的最主要原因。因此,探讨与结直肠癌发生、发展、诊断治疗密切相关的因素势在必行。结直肠癌患者经外科手术切除、化疗、放疗和生物治疗等综合治疗后,总体5年生存率仅近50%,仍占国内肿瘤死因的第4-6位,意味着目前的治疗不能彻底清除机体内的肿瘤细胞。肿瘤干细胞(cancer stem cell, CSC)学说认为在实体瘤中存在一部分细胞,具有与正常干细胞相似的自我更新能力和分化潜能,是肿瘤形成的种子和源泉。CSC与肿瘤的发生、治疗、预后、复发和转移关系极为密切。CSC增生分化为肿瘤细胞群与正常干细胞的分化过程十分相似,即肿瘤细胞群从肿瘤干细胞开始,经历肿瘤祖细胞、暂时性扩增细胞,最终分化为终末阶段的肿瘤细胞。传统观点认为干细胞及肿瘤干细胞是由不对称分裂方式生长分化的,即一个CSC一次分裂产生一个子代CSC和一个进入分化阶段的CSC,此种分裂方式既保持自我更新,又维持肿瘤细胞的自身分化发育潜能,防止CSC因分化而丢失干细胞特性。然而,从肿瘤的进展、演化、复发与转移的临床特征表现上分析,CSC不对称分裂不能够解释的现象有：①肿瘤由一个CSC起源,肿瘤持续增大和无限制的生长,不对称分裂只保存了一个CSC,单一CSC如何能够支撑强大的肿瘤群?②肿瘤经过外科手术完整移除后,原发瘤内的CSC也得以清除,为什么会出现复发?复发肿瘤中的CSC存活于哪?③肿瘤转移可在多处形成独立的肿瘤结节,每一瘤结节必须依赖一个CSC来维持该处的增生,这些结节内的CSC来源于何处?④肿瘤发生转移时,原发瘤仍旧存在,转移瘤内的CSC与原发瘤内CSC有何区别,多个CSC是通过哪种分裂增生方式形成的?CSC多次分裂后是否诱导CSC细胞群的异质性而产生转移潜能增高的CSC?不对称分裂不可能形成多个CSC。因此,我们推测,肿瘤细胞能够在短时间内大量扩增,多处转移结节形成出现多个CSC,肿瘤移除后使肿瘤复发的CSC,来源于CSC的对称分裂与扩增,即CSC除了不对称分裂保留干细胞特性以外,同时具有对称分裂特性,产生多个CSC,扩大CSC细胞池。明确CSC的对称分裂,就能解释肿瘤的持续扩增、复发与转移的CSC来源,解释相关的临床现象。在前期研究中,我们已采用了有限稀释法对结直肠癌系SW480进行单克隆培养,从而筛选出遗传背景相同的多个CSC克隆,应用裸鼠皮下成瘤和分化特性确定了结直肠癌CSC克隆的自我更新与分化能力。本课题拟以结直肠癌细胞系SW480细胞及从SW480中筛选的肿瘤干细胞(即SW480-CSC)为研究对象,通过单个细胞分离技术挑取单个SW480及单个SW480-CSC,利用免疫荧光技术观察单个细胞的子代细胞表型特征,判断肿瘤细胞群与SW480-CSC各单个细胞的对称分裂的发生率；并尝试应用SW480-CSC对称分裂解析结直肠癌临床化疗抵抗的相关机制。目的：1.探讨与优化单个肿瘤干细胞的分离和培养方法,为后期实验打下基础；2.探讨CD133、CK7在SW480及SW480-CSC细胞中的表达,明确单个细胞扩增后SW480-CSC标志物的表达特征；3.分析单肿瘤细胞与单个肿瘤干细胞首次分裂后子代细胞的表型特征,确定SW480-CSC对称分裂的发生率。4. SW480-CSC诱导分化后使用5-Fu分析对称分裂的变化,为阐明临床化疗耐药的机制提供研究模型。方法：1.单个结直肠癌干细胞的分离和培养方法的建立单个结直肠癌和肿瘤干细胞的分离和培养：a.选用显微操作法：利用制针设备制作合适的操作针,在显微操纵系统的载物平台上,通过机械臂调节左右操作针,在物理外力的作用下使用不同的方法分离单个SW480-CSC;b.口控单细胞分离装置：自制的单个细胞分离法,选用无菌塑料管两端分别连接灭菌的吸头及毛细玻璃管,利用虹吸原理,吸取单个细胞。96孔板及微滴培养法比较观察单个SW480-CSC的培养效率。2.结直肠癌干细胞对称分裂的分析以CD133及CK7作为标记物,使用免疫荧光技术标记结直肠癌干细胞球及结直肠癌细胞,确定CD133及CK7可以作为SW480-CSC的标记物。以此为基础,标记观察单个SW480-CSC及SW480细胞第一次分裂后的子代细胞表达特征,两个子代细胞均为肿瘤干细胞定义为对称分裂,一个子代细胞为肿瘤干细胞另一个为分化细胞定义为不对称分裂,判断肿瘤干细胞对称分裂的发生率。3.探讨5-Fu诱导后结直肠癌干细胞对称分裂的变化结直肠癌干细胞经5-Fu诱导后,再次应用CD133、CK7标记观察单个SW480-CSC第一次分裂后子代细胞的表达,统计对称分裂的发生率,比较用药前后对称分裂发生率的改变。MTT实验检测5-Fu诱导前后SW480-CSC的抑制率变化,软琼脂克隆形成实验观察5-Fu诱导前后SW480-CSC克隆形成的变化,Western blot检测5-Fu诱导前后CDK1、CDK4、CDK8、CyclinD1、CyclinBl在SW480-CSC中的表达。4.统计方法用SPSS13.0软件进行实验数据分析,两个独立样本率的χ2检验、完全随机设计两样本比较用t检验、完全随机设计多样本比较用单因素方差分析,单因素的方差分析两两比较采用LSD法,多因素样本比较用析因设计的方差分析。结果：1.单个SW480-CSC分离和培养的方法使用显微控仪法分离单个SW480-CSC发现,操作易损伤细胞膜,分离后SW480-CSC细胞膜破坏,通透性增加,培养基渗入细胞中,最终导致细胞死亡；而采用口控毛细管单细胞分离装置,在微滴中培养分离的单个细胞有效存活率为98.99%,96孔板培养分离的单个细胞有效存活率为95.8%,并且细胞生长状态良好。微滴培养和96孔板培养在单个SW480-CSC的第一次分裂、第二次分裂及持续扩增上差异无统计学意义(采用的两个独立样本率的χ2检验,χ2分别为1.236、0.750、0.385,P>0.05)。2.结直肠癌干细胞对称分裂的分析免疫荧光技术观察到,SW480-CSC中CD133表达强于SW480细胞,而CK7的表达低于SW480细胞。CD133及CK7的表达在两组细胞中差异具有统计学意义(采用两个独立样本的t检验,t值分别为73.451、60.803,p=0.000)。CD133和CK7可以作为结直肠癌肿瘤干细胞的标记物。免疫荧光技术检测SW480-CSC中对称分裂的概率为19.3900%±0.25942,不对称分裂的概率为35.6167%±1.42879,对称分化的概率为15.0100%±0.38223,不发生分裂的单个SW480-CSC为17.3500%±0.26058,单个分化细胞为9.5500%±0.47697,凋亡细胞为3.0833%±0.48809；SW480细胞中对称分裂的概率为1.3000%±0.26458,不对称分裂的概率为4.0633%±0.12741,对称分化的概率为47.1400%±0.46605,不发生分裂的单个SW480-CSC为0.5067%±0.4041,单个分化细胞为43.7367%±0.39703,凋亡细胞为3.1067%±0.82519,除凋亡细胞外SW480-CSC及SW480细胞之间分裂方式差异均有统计学意义(采用两个独立样本的t检验,t值分别为84.560、38.099、92.392、110.635、95.414,P=0.000)。说明了SW480-CSC对称分裂的存在。3.5-Fu实验性治疗后结直肠癌干细胞对称分裂的变化1)5-Fu处理后的SW480-CSC及SW480细胞在CD133及CK7表达差异具有统计学意义(采用两个独立样本的t检验,t值分别为80.528、106.629, P=0.000)。5-Fu处理后,SW480-CSC及SW480细胞之间分裂方式差异仍具有统计学意义(采用两个独立样本的t检验, t值分别为134.918、96.295、29.608、36.083、22.289、23.547,P=0.000)。5-Fu处理前后SW480-CSC在对称分裂、不对称分裂、单个SW480-CSC、单个分化细胞及凋亡细胞之间差异具有统计学意义(采用两个独立样本的t检验,t值分别为11.973、5.541、7.255、3.598、7.585,P<0.005)而对照组母系SW480细胞在对称分裂及单个干细胞之间差异无统计学意义(采用两个独立样本的t检验,t值分别为1.158、0.815,P>0.005),不对称分裂、对称分化、单个分化细胞及凋亡细胞之间差异具有统计学意义(采用两个独立样本的t检验,t值分别为6.761、39.539、12.672、41.485,P<0.005)这也就说明了诱导分化后,5-Fu实验性治疗降低了SW480-CSC的对称分裂,结直肠癌5-Fu的耐药与结直肠癌干细胞的对称分裂密切相关,诱导SW480-CSC分化后5-Fu能抑制SW480-CSC的对称分裂,抑制肿瘤增生。2)5-Fu诱导后的四组细胞(SW480serum、SW480no serum、SW480-CSC serum、SW480-CSC no serum)的MTT法检测显示,各组细胞的增殖受到不同的抑制,SW480-CSC serum、SW480-CSC no serum组随着药物作用时间的延长,抑制作用先增高然后逐渐降低。而对照组SW480serum、SW480no serum细胞随着药物作用时间的延长,抑制作用呈增高趋势,差异具有统计学意义(F=91.739,P=0.000)。说明5-Fu对SW480-CSC的影响随着时间的变化抑制率逐渐减弱。3)软琼脂集落形成实验统计学分析结果表明：软琼脂克隆形成实验显示SW480-CSC serum组在5-Fu处理前后克隆形成率差异具有统计学意义(t=9.642,P<0.05)；而SW480-CSC no serum组差异则无统计学意义(t=0.346,p>0.05)。说明5-Fu处理后SW480-CSC serum相对于SW480-CSC no serum组单个细胞的克隆能力降低,也就进一步表明5-Fu对肿瘤干细胞不敏感,而诱导分化后差异则具有意义。4)免疫印迹杂交结果显示,G1期指标中CDK4及CyclinD1在SW480-CSC中的表达弱于SW480组,5-Fu处理后CDK4两组细胞表达都略微升高,而CyclinD1表达未见明显变化,CDK8表达在用药前后的两组细胞中表达差异均不明显；M期指标CDK1及CyclinB1在SW480-CSC组表达明显强于SW480组,药物处理后两组细胞的表达差异不显著。结论：1.口控毛细管单细胞分离装置可以有效分离单个SW480-CSC,微滴和96孔板可以用来培养单个SW480-CSC。2. CD133、CK7可以作为SW480-CSC的标记。3. SW480-CSC可出现对称分裂扩充肿瘤干细胞池。4.5-Fu诱导分化后SW480-CSC对称分裂发生率降低,提示5-Fu耐药与结直肠癌干细胞对称分裂密切相关,从另一个角度解释结直肠癌临床化疗的抵抗。