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目的：近年来，结核病的发病率在全球范围内呈上升趋势，死亡率居各类传染病之首。针对全球结核病疫情恶化的现状，世界卫生组织(WHO)和世界上许多国家都重新制订了结核病的控制规范和标准的治疗方案，在世界卫生组织推荐的标准抗结核治疗措施中异烟肼(Isoniazid,INH)和利福平(Rifampin，RFP)仍然是不可替代的一线抗结核药物。二者联合应用时，对抗细胞内外结核杆菌有协同抗菌作用，并减少耐药性的发生，但二者合用又可明显增加肝毒性。目前，INH及其代谢物致肝毒性的作用、RFP对INH的代谢环节的影响机制等还未完全阐明。本课题拟探讨INH与RFP合用致肝毒性增加的部分作用机理，即INH及其代谢产物对小鼠肝细胞的毒性，以及RFP对INH小鼠肝细胞代谢的影响。
方法：采用在体心脏灌流法获取小鼠原代肝细胞，分两步灌流，灌流液分别为Buffer I液20mL，以清除血液；含0.05％IV型胶原酶的Buffer II液1mL·min-1灌流至肝脏变软。肝细胞分离、纯化和计数后调整细胞浓度为5×105cells·mL-1于不同培养板中培养并每日观察。小鼠原代肝细胞常规培养5d后，换含INH分别为0.05、1.5、45 mmol·L-1的培养液，乙酰肼(Acetylhydrazine，AHZ)0.05、1、20 mmol·L-1，肼(Hydrazine，HZ)0.05、0.5、5 mmol·L-1的培养液培养48h，MTT法检测INH、AHZ和HZ对小鼠原代肝细胞活性及存活率的影响。含INH(87.5μmol·L-1)、RFP(48.6μmol·L-1)、INH+RFP(87.5μmol·L-1+48.6μmol·L-1)培养液培养48h后，常规HE染色，光镜下观察肝细胞生长情况。采用柱前衍生化法结合LC/ESI-MS同时测定加药培养液中INH、AHZ和HZ的浓度。加药INH N(87.5μmol·L-1)、INH+RFP组(87.5μmol·L-1+48.6μmol·L-1)培养液经甲醇沉淀蛋白后，用衍生化试剂3-甲氧基苯甲醛(3-methoxybenzadlehyde，MBA)进行柱前衍生化，衍生化产物以甲醇-5mmol·L-1醋酸铵(pH5.0)缓冲溶液(60:40)为流动相，采用Agilent ZorbaxXDB C8柱(5μm，4.6mm×150mm)分离，通过ESI-MS以选择离子监测(SIM)模式进行检测，用于定量分析的离子分别为m/z 256.1[H]+(异烟肼衍生物)，m/z 193.2[H]+(乙酰肼衍生物)，m/z 151.1[H]+(肼衍生物)。结果：原代培养的小鼠肝细胞培养3d后，肝细胞大多形成集落且融合成片。MTT法测得与对照组比较，1.5mmol·L-1的INH使肝细胞存活率显著降低(P<0.01)；0.05mmol·L-1的AHZ和0.05mmol·L-1的HZ使肝细胞存活率显著降低(P<0.05)，浓度为5 mmol·L-1的HZ处理的肝细胞存活率只有(68.1±9.1)％；HE染色实验观察到INH组细胞核染色质浓缩，核碎裂、边聚等，INH+RFP组细胞核染色质致密浓缩，核碎裂、边聚等，或可见凋亡小体，正常对照组及RFP组则无上述表现。经LC-MS测定，与INH组比较，INH+RFP组INH含量显著降低(3.68％，P<0.05)，AHZ含量显著升高达(25.70％，P<0.01)，HZ含量显著升高(2.10％，P<0.01)。
结论：1.5mmol·L-1的INH，0.05mmol·L-1的AHZ，0.05mmol·L-1的HZ即可抑制肝细胞的活性，降低肝细胞的存活率，浓度仅为5 mmol·L-1的HZ已可显示出较强的肝细胞毒性。INH、AHZ和HZ等浓度(0.05mmol·L-1)时，AHZ和HZ均表现出比INH更强的肝细胞毒性。RFP对INH的肝代谢影响研究显示RFP能促进INH的代谢，代谢产物AHZ及HZ均显著增加，表明INH和RFP合用后代谢产物AHZ和HZ浓度增加，是其肝毒性增加的原因之一。