目的:弥漫性轴索损伤(diffuse axonal injury, DAI)是指头部遭受钝性特殊外力,产生加速运动时,在剪应力的作用下,脑内发生的以神经轴索肿胀、断裂为特征的一系列的病理生理变化,可单独出现也可伴随其他病理改变。典型的表现为意识障碍,临床诊断较困难且预后差。已有研究表明,DAI造成外伤后的脑功能障碍不仅是由于最初的机械外力等作用所致的原发性损伤,很大程度上与损伤后发生的复杂的神经元“二次打击”(神经元继发性损伤)有关~[1-2]。前期实验已经观察到大量的小胶质细胞在DAI后被激活,且小胶质细胞介导的炎症反应及呼吸爆发在DAI后继发性神经损伤中发挥作用。但是神经损伤的机制不仅限于直接的细胞因子的作用,小胶质细胞激活后产生的毒性作用更为重要。研究显示小胶质细胞在中枢神经系统中不仅起支持和营养作用,同时作为中枢神经系统内兴奋性氨基酸代谢的重要场所[3],小胶质细胞的激活可释放大量的兴奋性氨基酸,同时兴奋性氨基酸也可进一步激活小胶质细胞。而兴奋性氨基酸过多产生的兴奋毒性作用在许多神经系统疾病中可以导致神经损伤,包括炎症、缺血及神经退行性变[4]。而小胶质细胞在DAI模型中介导的兴奋性氨基酸在神经损伤中的作用尚不明确。本实验旨在参照1994年~[5]Marmarou A等的方法建立大鼠DAI模型,并给予小胶质细胞特异性抑制剂米诺环素进行治疗,采用小胶质细胞特异性标记物,通过免疫组织化学方法,观察DAI后激活的小胶质细胞分布特点及米诺环素对小胶质细胞激活的抑制作用。并通过高效液相色谱对脑组织中的兴奋性氨基酸进行定量分析,观察DAI后兴奋性氨基酸的变化及米诺环素对兴奋性氨基酸变化的影响,探讨兴奋性氨基酸的促损伤作用。以期为法医学实际检案工作中对DAI损伤的客观评价提供理论依据,并为临床治疗提供新思路。方法:Sprague-Dawley大鼠(体重: 260±28g)随机分为三组:假手术组、损伤组、治疗组;每组包括9个不同时相:0h、1h、3h、6h、12h、24h、48h、72h、7d。参照Marmarous A等的方法制备大鼠脑DAI模型。假手术组大鼠给予手术及打击前处理,但不予打击;损伤组和治疗组给予打击;打击后治疗组腹腔注射米诺环素(45mg/kg),之后每天一次,直至动物被处死。损伤组在与治疗组相同时间点腹腔注射同剂量的生理盐水。根据打击后按不同时间给予10%水合氯醛麻醉后取全脑,制作石蜡切片,采用HE染色观察大鼠脑组织的病理改变。用免疫组织化学的方法测定脑组织中皮层及脑干损伤区小胶质细胞的表达状况。用高效液相色谱法测定脑组织中兴奋性氨基酸的含量变化。统计数据采用均数士标准差(Mean士SD)表示,用SPSS统计分析软件进行统计学分析,各组小胶质细胞灰密度值及兴奋性氨基酸各组均数的比较行单因素方差分析(ANOVA),以p<0.05为有显著性差异。结果:1成功建立弥漫性轴索损伤模型:常规HE染色观察,损伤后12h组织结构疏松,神经元变性水肿明显,部分神经元坏死,大量小胶质细胞增生伴嗜神经现象;损伤后24-48h组织损伤加重。72h逐渐好转。而治疗组各时段与损伤组相比,组织疏松程度较轻,小胶质细胞增生较少,水肿不明显。2 CD11b免疫组化结果的观察:损伤组6h时CD11b染色较浅,数量较少;打击后12h小胶质细胞数量明显增加突起变粗、变短,胞体增大、变圆。皮层CD11b的表达在打击后12h达到高峰,脑干CD11b的表达在打击后24h达到高峰;之后逐渐减少;72h仍可见。治疗组与损伤组小胶质细胞的激活趋势相同,但数量及形态上有一定差异。治疗组表达在6h前与损伤组没有统计学差异。12h、24h、48h、72h与损伤组有明显差异(p<0.05)。3高效液相色谱对谷氨酸及天门冬氨酸的测定:各组脑组织测定结果:与假手术组相比,损伤组皮层脑组织在损伤后谷氨酸及天门冬氨酸即有明显升高,12h到达高峰,之后逐渐下降,7d后基本恢复正常。而治疗组与损伤组趋势相同,12h-72h均低于损伤组(p<0.05),72h已基本恢复正常。损伤组脑干组织在损伤后谷氨酸和天门冬氨酸即明显高于正常,24h达到高峰,之后逐渐下降,7d后基本恢复正常。而治疗组与损伤组趋势相同,12h-72h均低于损伤组(p<0.05),72h已基本恢复正常水平。结论:采用Marmarou A的自由落体撞击模型复制了大鼠DAI模型,观察到DAI后米诺环素可以抑制小胶质细胞的激活,且大鼠皮层及脑干谷氨酸及天门冬氨酸的含量与小胶质细胞的激活在时空上相关。米诺环素可以通过抑制小胶质细胞的激活作用降低脑组织中谷氨酸及天门冬氨酸的含量;在一定程度上说明兴奋性氨基酸与小胶质细胞的激活密切相关。小胶质细胞介导兴奋毒性反应在时程和区域上,与继发性损伤密切相关,在一定程度上证实小胶质细胞介导的兴奋毒性反应在DAI后继发性轴索损伤中发挥作用。