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目的:1.通过生物信息学网站预测靶向Sp110的microRNA(miRNA)。2.通过在THP-1细胞中检测miRNA本底水平进一步筛选miRNA。3.应用双荧光素酶实验验证miR-6857-3p和Sp110存在靶向关系。4.应用实时荧光定量PCR(qPCR)技术研究miR-6857-3p对Sp110的调控作用。5.研究miR-6857-3p对卡介苗感染的巨噬细胞凋亡的影响。方法:1.用生物信息学网站(TargetScan、miRDB和miRTarBase)预测可能和Sp110具有靶向关系的miRNA(miR-6857-3p、miR-19a-5p、miR-4772-3p、miR-4659-5p和miR-5696)。2.提取人巨噬细胞(THP-1细胞)中的总RNA,将miRNA反转录为cDNA,应用qPCR技术检测先前预测的5种miRNA的本底表达水平,采用2-△ct法计算相对表达量,筛选表达量最高的3种miRNA(miR-6857-3p、miR-4659-5p和miR-4772-3p)进行双荧光素酶实验。3.从数据库中获取miR-6857-3p、miR-4659-5p和miR-4772-3p与Sp110 3’UTR的结合序列,将序列克隆到psiCHECK-2质粒中萤火虫荧光蛋白3’UTR的下游,命名为Sp110野生型质粒(psiCHECK-2-Sp110-3’UTR)。同时构建miRNA过表达质粒(miR-6857-3p mimic、miR-4772-3p mimic、miR-4659-5p mimic和miRNA mimic nc)。分别将不同miRNA过表达质粒和Sp110野生型质粒共转染到293T细胞,实验共分4组,转染48小时后进行荧光活性测定。此外,将miR-6857-3p与Sp110 3’UTR的结合序列进行突变,将突变序列按同样方式克隆到报告载体中,命名为Sp110突变型质粒(psiCHECK-2-Sp110-3’UTR-6857mut)。将miR-6857-3p mimic和miRNA mimic nc分别和Sp110突变型质粒共转染到293T细胞,转染48小时后进行荧光活性测定。4.用佛波酯(PMA)将THP-1细胞促分化为巨噬细胞,用miR-6857-3p模拟物(mimic)和抑制物(inhibitor)分别转染促分化后的THP-1细胞,24小时后用qPCR技术检测THP-1细胞中miR-6857-3p的表达量。对转染成功的THP-1细胞进行RNA提取,之后反转录为cDNA,再进一步应用qPCR技术检测Sp110 mRNA的表达量,用2-△ct法计算相对表达量,比较差异。5.用miR-6857-3p mimic和miR-6857-3p inhibitor分别转染促分化后的THP-1细胞,转染24小时后用卡介苗(Bacillus Calmette-Guérin,BCG)以感染复数(MOI)10:1感染细胞,感染6小时后记为0小时,清洗去除多余细菌,在24小时时应用流式细胞技术检测巨噬细胞凋亡情况。结果:1.通过生物信息学网站筛选出靶向Sp110的miRNA为miR-6857-3p、miR-19a-5p、miR-4772-3p、miR-4659-5p和miR-5696。2.THP-1细胞中5种miRNA表达水平检测显示miR-6857-3p表达量最高,之后依次为miR-4659-5p、miR-4772-3p、miR-19a-5p和miR-5696。3.双荧光素酶实验结果显示与对照组相比,携带miR-6857-3p mimic和Sp110野生型质粒的荧光素酶活性产生明显下降(P<0.001),miR-4659-5p和miR-4772-3p组的荧光素酶活性也出现降低(P<0.05)。将Sp110 3’UTR突变后miR-6857-3p mimic的荧光素酶活性出现回升。4.在THP-1细胞中转染miR-6857-3p mimic后,miR-6857-3p表达量升高。在THP-1细胞中转染miR-6857-3p inhibitor后,miR-6857-3p表达量降低。qPCR结果显示miR-6857-3p mimic组Sp110 mRNA水平出现明显降低(P<0.001),在miR-6857-3p inhibitor组中Sp110 mRNA表达水平出现明显上调(P<0.001)。5.流式细胞技术检测凋亡结果显示,miR-6857-3p mimic组细胞凋亡较对照组减少(P<0.05),miR-6857-3p inhibitor组细胞凋亡较对照组增多(P<0.01)。结论:1.miR-6857-3p和Sp110具有靶向关系。2.miR-6857-3p负向调控Sp110 mRNA的表达。3.miR-6857-3p抑制卡介苗感染的巨噬细胞凋亡。