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第一部分共培养诱导弥漫大B细胞淋巴瘤细胞系Toledo向干细胞样细胞转化目的：探讨将弥漫大B细胞淋巴瘤细胞系Toledo与小鼠骨髓基质细胞共培养后能否诱导前者向干细胞样细胞转化。方法：建立弥漫大B细胞淋巴瘤细胞系Toledo-小鼠骨髓基质细胞系OP9共培养体系；以MTT法、CFSE标记法检测共培养对Toledo细胞增殖能力的影响；以MTT法、Annexin-V/PI双染法检测共培养对Toledo细胞对化疗药物耐药性的影响；以Brdu/7-AAD双染法检测共培养对Toledo细胞周期的影响。检测共培养对Toledo细胞克隆形成能力的影响。以流式细胞仪检测共培养后Toledo细胞CD44、CD90、CD27和CD133的表达；以实时荧光定量PCR检测共培养对Toledo细胞BMI1和HES1基因转录的影响。结果：与小鼠骨髓基质细胞OP9共培养后,应用MTT法检测细胞活力,结果显示共培养后的To1edo细胞比单独培养的Toledo细胞在48h(t=-3.161,P=0.010)和72h(t=2.662,p=0.024)具有更高的OD值；CFSE标记法检测结果显示共培养后的Toledo细胞比单独培养的Toledo细胞在24h(t=-27.613,P=0.000)、48h(t=-15.058,P=-0.000)和72h(t=-29.874,P=0.000)的MFI值更低。在培养基中加入阿霉素作用48h后,应用MTT法检测细胞活力,结果显示共培养组Toledo存活率达(54.80±1.88)%,明显高于单独培养组[(34.58±3.69)%](t=13.127,P=0.000)；应用Annexin-V/PI检测加入阿霉素后不同组别细胞凋亡,发现共培养组Toledo凋亡和坏死细胞占(8.84±0.10)%,明显少于单独培养组[(58.15±1.17)%](t=-73.042,P=0.000)。细胞周期分析显示共培养后(80.30±1.26)%的Toledo细胞处于GO/G1期,比例明显高于单独培养组[(44.88±2.01)%](t=25.840,P=-0.000).共培养后Toledo细胞克隆形成率达(0.41±0.05)%,显著高于单独培养组[(0.03±0.01)%](t=14.125,P=0.000)。单独培养的Toledo表达少量CD44[(0.39±0.05)%].CD90[(0.07±0.01)%].CD27[(0.04±0.01)%]和CD133[(0.02±0.01)%]；共培养后Toledo细胞CD133阳性细胞比例明显升高[(2.59±0.49)%](t=--9.083,P=0.001)。共培养后Toledo细胞BMI1(t=3.053,P=0.038)和HES1mRNA(t=3.100,P=0.036)RQ值显著高于单独培养的Toledo细胞。结论：与小鼠骨髓基质细胞共培养后,Toledo细胞获得了更强的增殖能力、耐药性和克隆形成能力,更多的细胞处于G0/G1期,上调表达干细胞标记物CD133和自我更新相关基因BMI1和HES1,有向干细胞样细胞转化的趋势。第二部分共培养诱导弥漫大B细胞淋巴瘤细胞系Toledo向干细胞样细胞转化的机制研究目的：探究共培养诱导弥漫大B细胞淋巴瘤细胞系Toledo向干细胞样细胞转化的机制方法：为了检测STAT3是否在Toledo细胞内活化,以Western Blot检测单独培养和共培养后Toledo细胞p-STAT3表达情况。在共培养体系建立时加入AG490以抑制STAT3活化,再以CFSE标记法检测其对共培养后Toledo细胞增殖的影响；以Annexin-V/PI双染法检测AG490对共培养后Toledo细胞对阿霉素敏感性的影响；以Brdu/7-AAD双染法、PI单染法检测AG490对Toledo细胞周期的影响。以AG490抑制STAT3通路后,检测其对共培养后Toledo细胞在甲基纤维素半固体培养基上形成克隆能力的影响。在共培养体系中加入AG490后,检测其对共培养后Toledo细胞CD133表达的影响以及BMI1和HES1基因转录的影响。结果：共培养后Toledo细胞内可检出p-STAT3表达；而单独培养的Toledo细胞未见p-STAT3表达。在共培养体系建立时加入AG490,共培养后Toledo细胞p-STAT3表达明显减弱。CFSE检测结果显示含有AG490的共培养组Toledo细胞较未加入AG490的共培养组Toledo细胞在24h(t=-14.822, F=0.000)、48h(t=-12.954, P=0.000)和72h(t=-14.041, P=0.000)MFI值明显升高。Annexin-V/PI检测结果显示阿霉素作用48h后,含AG490的共培养组Toledo细胞凋亡和坏死细胞占(16.07±1.46)%,明显高于不含AG490的共培养组Toledo细胞[(8.15±0.51)%](t=-8.871, P=0.001)。PI单染检测结果显示,不含AG490的共培养组Toledo细胞G0/G1期细胞比例在(68.04±1.64)%,明显高于含有AG490的共培养组Toledo细胞[(56.09±2.87)%](t=2.733,P=-0.032)；Brdu/7-AAD检测结果显示,不含有AG490的共培养组Toledo细胞G0/G1期细胞占(80.25±0.78)%,明显高于含有AG490的共培养组Toledo细胞[(43.93±0.70)%](t=60.015,P=0.000)。不含AG490的共培养组Toledo细胞克隆形成率达(0.44±0.05)%,明显高于含AG490的共培养组Toledo细胞[(0.18±0.06)%](t=5.534,P=0.005)。不含AG490的共培养组Toledo细胞CD133阳性细胞占(3.28±0.12)%,明显高于含有AG490的共培养组Toledo细胞[(0.79±0.03)%](t=37.427,P=0.000)。加入AG490后,共培养组Toledo细胞BMI1(t=4.455, P=0.011)、HES1(t=3.529, P=0.024)RQ值显著低于不含AG490的共培养组Toledo细胞。结论：与小鼠骨髓基质细胞共培养使Toledo细胞STAT3活化。AG490可以抑制共培养所引起的STAT3活化。AG490可以减少共培养对Toledo细胞增殖的促进作用,减少共培养所导致耐药性的增加,减少G0/G1期细胞比例,减少共培养对Toledo细胞克隆形成的促进作用,减少干细胞标记物CD133的表达,减少自我更新基因BMI1和HES1的转录。提示AG490可以通过抑制STAT3活化来抑制Toledo细胞向干细胞样细胞转化。弥漫大B细胞淋巴瘤细胞系Toledo向干细胞样细胞转化依赖于STAT3活化。