【摘 要】
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旋毛虫(Trichinella spiralis,T.spiralis)是一种人兽共患食源性寄生虫,生食或半生食含有旋毛虫的猪肉及其产品是人类感染旋毛虫的主要方式,因感染旋毛虫而引起的疾病被称为旋毛虫病(Trichinellosis),该病呈世界性分布且严重威胁人类健康和公共安全,因此,猪旋毛虫检测被列为屠宰必检项目。目前使用的旋毛虫检测方法存在技术短板,无法满足对日常养殖和现代化屠宰加工过程中,
【基金项目】
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国家重点研发计划《食品中生物性及放射性危害物高效识别与确证关键技术及产品研发》(2018YFC1602500); 国家重点研发计划(2017YFD0501300、2017YFC1601200); 国家自然基金项目(31520103916、31872467);
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旋毛虫(Trichinella spiralis,T.spiralis)是一种人兽共患食源性寄生虫,生食或半生食含有旋毛虫的猪肉及其产品是人类感染旋毛虫的主要方式,因感染旋毛虫而引起的疾病被称为旋毛虫病(Trichinellosis),该病呈世界性分布且严重威胁人类健康和公共安全,因此,猪旋毛虫检测被列为屠宰必检项目。目前使用的旋毛虫检测方法存在技术短板,无法满足对日常养殖和现代化屠宰加工过程中,猪体内旋毛虫的监测。因此,针对现代化大型养殖和屠宰场研发一种快速、灵敏的旋毛虫现场检测方法,对于旋毛虫病防控具有重要意义。本研究基于表面增强拉曼光谱(Surface-enhanced Raman spectroscopy,SERS)和上转换发光免疫层析法(Upconversion phosphor immunochromatography assay,UCP-ICA)建立旋毛虫快速检测体系,为研发适用于现代化大型养殖和屠宰场的旋毛虫检测方法奠定基础,具体研究内容和结果如下:1.基于SERS建立旋毛虫检测方法。利用盐酸羟胺还原硝酸银,制备银纳米溶胶,测试其拉曼光谱增强性能及其对实验样品的影响。20只Wistar大鼠口服感染旋毛虫肌幼虫(Muscle larvae,ML)(3500条/只),并设平行空白对照组(20只Wistar大鼠)。收集血清,采用激光共聚焦显微拉曼光谱仪采集未感染的血清及感染后28天血清的SERS,对SERS进行去荧光背景及面积归一化处理。比较SERS变化以及通过多元统计分析,如主成分分析(Principal component analysis,PCA)和线性判别分析(Linear discriminant analysis,LDA),分析SERS并建模。结果表明,所制备的银纳米溶胶颗粒直径约为25 nm,大小均匀,纯度高,且具有良好的拉曼光谱增强效果。感染组和对照组在未感染旋毛虫时的血清拉曼光谱无显著差异;第28天,两组的血清拉曼光谱出现显著差异。通过PCA结合LDA构建诊断算法,发现该方法灵敏度为87.5%,特异度为94.7%,正确度为91.4%。基于以上结果,将银纳米胶体的SERS与PCA和LDA相结合,有望实现大规模、现场、快速、无标记、高准确检测,在旋毛虫病防控方面具有巨大的应用潜力。2.基于UCP-ICA建立旋毛虫免疫层析检测法。将旋毛虫排泄分泌抗原(Excretorysecretory antigens,ES)、山羊抗兔Ig G与上转换发光纳米颗粒(Upconversion nanoparticles,UCNPs)共价偶联,以山羊抗猪Ig G(800 ng/条)与兔抗山羊Ig G(200 ng/条)喷于硝酸纤维素薄膜(Nitrate cellulose sheet,NC sheet)上,分别作为检查带(T线)与质控带(C线),并且命名该方法为旋毛虫上转换发光免疫层析法(T.spiralis upconversion phosphor immunochromatography assay,Ts-UCP-ICA)。Ts-UCP-ICA优化后的最佳血清稀释倍数为1:150、最佳样品处理液为100 m M HEPES p H 7.5,270 m M Na Cl,0.5%v/v Tween-20,1%v/v BSA。通过检测169份阴性猪血清,确定Ts-UCP-ICA的低特异度cut-off值为0.1906(T/C ratio),高特异度cut-off值为0.3233。检测猪囊尾蚴、亚洲带绦虫幼虫以及弓形虫感染后的猪血清样本,结果显示,Ts-UCP-ICA特异性良好,均未发生交叉反应。检测感染100、1000、10000 ML猪血清,发现三个剂量分别在第35、30、25天可检出阳性。Ts-UCP-ICA单盲测试(Single-blinded assay)55份猪血清,使用低特异度cut-off值时,检测特异度和灵敏度均100%,使用高特异度cut-off值时,检测特异度为100%和灵敏度为80%。该方法与人工消化法的检测总符合率为87.27%,一致性系数(Kappa值)为0.7454,稳定性为4℃保存6个月有效。本论文建立的两种旋毛虫检测方法,构成“旋毛虫快速检测体系”。基于SERS建立的旋毛虫检测法具有检测速度快,高通量的特点,适合大规模样本筛查;而基于UCP-ICA建立的旋毛虫检测方法可用于可疑血清进一步确定。该检测体系可提高检测效率和检测效果,进一步提升旋毛虫流行病学调查、畜牧养殖及屠宰即时检测水平,为旋毛虫病防控提供技术保障。
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