疼痛是人们在不同的病理状态下由大脑所产生的一种不愉悦的感觉，而长期的慢性痛则在全世界的范围内成为严重影响患者生命质量的重要疾病。因此，阐明疼痛发生和传递的机制，开发更有效的镇痛新药以及临床上对于疼痛的靶向治疗，已经成为当今生命科学研究领域的热点问题[1]。背根神经节（dorsal root ganglion, DRG）和脊髓背角是躯体感觉信息（包括痛觉信息）传递和调控的初级门户，位于其内的谷氨酸在外周痛觉信息的传递中具有重要作用。已有的研究证实，在对痛觉信息的传递和调控过程中，谷氨酸是其中最主要的神经递质之一，谷氨酸在神经元的胞体合成后须由突触囊泡进行转运并胞吐释放才能发挥其兴奋性递质的作用，这种转运方式又必须借助特定的囊泡膜谷氨酸转运体(vesicular glutamate transporters, VGLUTs)来完成。近10年，研究人员利用快速发展的分子生物学技术成功地分离并克隆出了不同亚型的囊泡膜谷氨酸转运体，并将之命名VGLUT1、VGLUT2、 VGLUT3[2,3]。由于VGLUT1和VGLUT2广泛分布于谷氨酸能轴突终末内，故目前在国际上人们已经将VGLUT1和VGLUT2作为中枢神经系统内谷氨酸能终末的特异性标记物[4]。谷氨酸参与感觉信息的传递和调控的结构基础在于它不仅分布在投射神经元内，在中间神经元内也有广泛的分布，而新近研究也发现在长传导通路的各级核团和中间神经元内均有VGLUT2的分布；进一步的研究也证实DRG和脊髓背角内有大量的VGLUT2表达神经元和轴突终末[5]。目前在国内外由于缺乏针对VGLUT2特异性的激动剂和拮抗剂，导致对VGLUT2所参与外周痛觉信息传递和调控机制的研究十分困难[6,7]。随着分子生物学技术的迅速发展，基因敲除技术很好的解决了这一难题。然而，基因敲除技术对于针对VGLUT2为疼痛的靶点，作为临床上开发有效的镇痛药而言显然是不现实的。随着基因阻断技术的发展，RNA干扰技术（RNA interference, RNAi）为特定基因功能研究和相关疾病的治疗提供了一种全新的思路。脊髓背角的中间神经元（同样作为躯体感觉信息传递和调控的关键部位），其内的VGLUT2与外周疼痛信息的传递和调控的关系如何，到目前为止尚不十分清楚。另外，脊髓内VGLUT2样阳性终末由于既来源于初级传入神经元（DRG），也来自于脊髓中间神经元本身，因此在慢性痛状态下，这两部分来源的VGLUT2究竟是怎样参与痛觉信息的传递和调控的，目前也无文献报道。针对这两个问题，我们拟综合采用RNA干扰技术结合顺行束路追踪、免疫荧光组织化学、细胞培养和电生理学技术从以下几个方面进行了研究。第一部分：将携带有两种不同VGLUT2shRNA序列的慢病毒载体，感染在体外原代培养的脊髓神经元，进一步验证并筛选能够最有效下调脊髓神经元内VGLUT2表达的慢病毒载体。目的：验证已经在体外培养的皮层神经元上筛选得到的可以特异性干扰VGLUT2表达的两种慢病毒是否能够有效地感染原代培养的大鼠脊髓神经元，筛选出能够最高效干扰培养脊髓神经元内的VGLUT2基因表达的慢病毒。方法：首先将这两种重组慢病毒直接感染体外培养的胚胎大鼠脊髓神经元，实验分为正常组、阴性对照组（空病毒载体组）、VGLUT2-shRNA-1组以及VGLUT2-shRNA-2组，分别观察各组大鼠脊髓神经元内绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）的表达情况；同时运用免疫蛋白质印迹（Western Blot）技术检测VGLUT2蛋白的表达水平。结果：免疫荧光组织化学染色结果显示：阴性对照组、两组VGLUT2-shRNA慢病毒组脊髓神经元内均可以观察到GFP的荧光，提示这些神经元已经被慢病毒载体高效地感染；但两组VGLUT2-shRNA慢病毒组神经元内的VGLUT2的表达量要明显比正常组和阴性对照组低。Western Blot结果显示：两组VGLUT2-shRNA慢病毒组脊髓神经元内VGLUT2蛋白的表达量明显低于其他两组的表达量(P<0.05)，其中VGLUT2-shRNA-1组和VGLUT2-shRNA-2组VGLUT2蛋白的表达量分别占正常组表达量的62.42±1.12%和66.07±1.33%，但两组VGLUT2-shRNA慢病毒组组间的VGLUT2蛋白的表达量相比无明显差异(P>0.05)；阴性对照组和正常组之间相比也无明显差异(P>0.05)。结论：两组VGLUT2-shRNA重组慢病毒均能高效地感染原代培养脊髓神经元，并且能够下调脊髓神经元内VGLUT2的表达。第二部分：将在体外有效降低VGLUT2的两种shRNA重组的慢病毒，通过定位注射方式注入大鼠脊髓背角，进而感染脊髓背角神经元，观察下调其内VGLUT2的表达对SNL神经病理性痛模型大鼠的机械性痛敏的影响。并利用膜片钳技术，在红外可视膜片钳下对下调脊髓背角内VGLUT2表达后大鼠的离体脊髓薄片背角浅层神经元的电生理特性进行分析。目的：观察靶向下调大鼠脊髓背角内VGLUT2的表达对动物痛行为的改变以及对神经元的电生理特性和突触可塑性的影响。方法：（1）制备L5脊神经结扎（spinalnerve ligation，SNL）的神经病理性痛模型。(2)将在体外培养神经元上有效下调VGLUT2表达的两种shRNA重组慢病毒，通过定位注射方式感染大鼠脊髓神经元，观察对神经病理性痛模型大鼠疼痛相关行为的影响。(3)体外培养急性分离的大鼠脊髓薄片，并感染有效降低VGLUT2的shRNA重组慢病毒载体，观察对大鼠脊髓背角浅层神经元的电生理特性的影响。结果：(1)大鼠在SNL术后第1d即表现出明显的机械性痛敏和热痛敏，在第3d时痛敏最为明显。(2)重组的慢病毒可以高效地感染大鼠的脊髓背角神经元并抑制其内VGLUT2的表达；Western Blot结果显示：VGLUT2-shRNA-1组和VGLUT2-shRNA-2组VGLUT2蛋白的表达量下降，分别为正常组表达量的20.71±5.52%和19.74±3.92%；同时能够降低大鼠对于伤害性热和机械性刺激的反应阈值，并明显缓解SNL神经病理性痛模型大鼠的痛敏行为。(3)在体外培养急性分离的大鼠脊髓薄片上，脊髓背角神经元感染病毒后其自发性兴奋性突触后电流(sEPSC)的幅度减小，频率有所降低。结论：靶向下调大鼠脊髓背角内VGLUT2的表达能够影响神经元的功能并缓解大鼠的痛行为。第三部分：利用neurobiotin顺行束路追踪技术区分出脊髓背角内VGLUT2从DRG（初级神经元）和脊髓背角（二级神经元）的来源分布，并观察SNL神经病理性痛模型大鼠脊髓背角初级传入终末内VGLUT2的时程变化。目的：观察SNL神经病理性痛模型大鼠脊髓背角初级传入终末内VGLUT2的时程变化。方法：利用neurobiotin顺行束路追踪技术标记所有DRG向脊髓背角浅层的初级传入纤维，利用VGLUT2的抗体标记脊髓背角内VGLUT2阳性终末的分布。通过neurobiotin/VGLUT2免疫荧光双标染色区分VGLUT2从DRG（初级神经元）和脊髓背角（二级神经元）的来源分布；并以此观察SNL模型大鼠在L5脊神经结扎后不同时间点脊髓背角内初级传入终末内VGLUT2的表达变化。结果：在脊髓背角内可以清晰地观察到neurobiotin顺行标记的初级传入纤维和终末，同时也可观察到部分阳性终末呈VGLUT2样阳性，这些neurobiotin/VGLUT2双标轴突终末的数量（%）随着SNL神经病理性痛的时间延长（0d，1d，3d，5d，7d）而逐渐增多。结论：脊髓背角初级传入终末内VGLUT2的表达增多可能与神经病理性痛导致的慢性痛的发生密切相关。