论文部分内容阅读
目的：胃癌是世界上死亡率最高的恶性肿瘤之一，东亚地区是其主要高发地区。大量的研究已经证实在不同类型癌症患者的血浆中可以检测到特异性的miRNA分子，血浆miRNA分子有望成为肿瘤检测的标志物分子。长链非编码RNA（lncRNA）近来被广泛关注，lncRNA在肿瘤发生发展过程中的重要作用也已被广泛认可。本研究通过筛选、鉴定获得胃癌患者血浆miRNA候选标志物分子，并探讨其做为胃癌肿瘤检测标志物的可行性；开展胃癌差异表达长链非编码RNA筛选鉴定，为获得胃癌检测长链非编码RNA标志物研究奠定基础；同时建立检测miRNA分子新方法。方法：1)取24例胃腺癌血浆样本和24例非肿瘤血浆样本分别进行混合，针对135个候选miRNA分子，通过实时定量PCR的方法检测并获得候选miRNA。在验证阶段，用188例独立的血浆样本（99例胃癌，89例对照）进行检测分析miRNA。2)取2组胃腺癌组织和癌旁组织，利用Arraystar HumanLncRNA芯片检测胃癌组织中lncRNA相对表达水平。选取差异表达的lncRNA，对47例胃腺癌组织及癌旁组织和6种胃癌细胞系进行实时定量PCR检测分析。3)采用poly（U）聚合酶在miRNA3′末端添加U尾，反转录为cDNA，实时定量PCR检测miRNA。结果：1)在混合血浆中对135个miRNA进行检测，获得了候选miRNA。进一步验证发现miR-378、miR-379、miR-485-3p、miR-885-5p、let-7a、let-7f在胃癌患者组血浆中的表达量相对于对照组差异具有统计学意义。结合临床资料对上述6个miRNA进行分析，发现其对胃癌检测胃癌分期等的预判有辅助价值。2)Arraystar Human LncRNA芯片检测结果提示胃癌组织与癌旁组织表达谱存在差异，采用实时定量PCR分析获得了5种lncRNA：AK001058、AL359062、NR015379、uc002.the和AK025209在47例胃癌组织和癌旁组织中，以及在6种胃癌细胞系中的表达谱。3)经poly（U）聚合酶加尾的RT-PCR方法可以成功有效的检测miRNA分子。结论：本研究获得了胃癌检测的候选miRNA标志物分子，具有潜在的临床应用价值。初步了解lncRNA与胃癌之间的关系，并构建了lncRNA的表达载体。本研究建立的poly（U）加尾RT-PCR方法可有效地检测分析miRNA分子，具有特异性强，灵敏度高的特点，为miRNA的检测分析及功能机制研究提供了一种新方法。