“脾应长夏”是指长夏季节,脾藏象处于机体气机升降的支配地位,调控人体气机完成由“升”转“降”的变化,维持机体各个功能系统的正常运行。病理上,脾虚证是导致“脾应长夏”季节性变化规律紊乱的重要原因,也是引起诸多疾病在长夏季节高发的根本原因。脾虚泄泻作为长夏季节高发的疾病之一,目前关于其季节性发病机制的研究较少。基于此,本课题拟将“脾应长夏”理论与泄泻发病机制研究成果相结合,探讨长夏环境中脾虚型泄泻发病机制,从病理角度揭示“脾应长夏”理论的科学内涵,以期为“五藏应时”理论研究提供新思路,同时也为临床上防治脾虚泄泻提供理论与实验依据。1研究目的基于中医学“脾应长夏”理论与肠道微生物介导的细胞信号转导机制,研究脾虚证对于肠道菌群及其代谢产物调控的线粒体能量代谢和经腺苷酸环化酶（Adenylate cyclase,AC）/环磷酸腺苷（Cyclic adenosine mono-phosphate,cAMP）/蛋白激酶 A（Protein kinase A,PKA）途径调控肠道水通道蛋白（Aquaporins,AQPs）的影响,进一步解释脾虚泄泻长夏季节高发的微观机制。2研究方法2.1理论研究采用文献梳理和理论探讨法,搜集、整理、归纳和总结“脾应长夏”、肠道菌群及其代谢产物、肠道细胞线粒体能量代谢及经AC/cAMP/PKA途径调控肠道AQPs的理论与实验研究,探讨脾虚泄泻长夏高发的微观机制,从病理层面反证“脾应长夏”的科学内涵。2.2实验研究2.2.1实验设计模拟长夏季节温度、湿度和光照时间,以5周龄SD雄性大鼠为实验对象,以肠道菌群门水平结构、属水平结构,代谢产物,脂肪酸β-氧化速率,线粒体呼吸链复合体Ⅰ～Ⅴ,三磷酸腺苷（Adenosine triphosphate,ATP）,AC、cAMP、PKA,AQP3、AQP4、AQP8为检测指标,研究空白组（BLANK组）、单因素脾虚模型组（MODEL1组）和复合因素脾虚模型组（MODEL2组）肠道菌群及其代谢产物经AC/cAMP/PKA途径调控AQPs的表达水平。通过对比模型组与空白组的差异,探讨长夏季节脾虚泄泻高发的生物学机制。2.2.2实验动物及模型复制购买24只平均体重为200g左右的SPF级雄性近交SD大鼠,饲养于设置成长夏季节的人工气候模拟箱中随机分为3组,每组8只,分别是BLANK组、MODEL1组和MODEL2组。BLANK组不予干预;MODEL1组采取劳倦过度法建立脾虚模型;MODEL2组采取劳倦过度结合饮食不节法建立脾虚模型。2.2.3指标检测方法（1）对比研究脾虚大鼠肠道传输速率及水液代谢情况:a.观察肠道传输功能:采用活性炭灌胃法测定首粒黑便时间;b.收集24h粪便先后测湿重和干重计算粪便含水量;c.取近肛门2cm结肠先后测湿重和干重计算含水量。（2）对比研究脾虚大鼠肠道菌群及代谢情况:a.对比研究脾虚大鼠肠道菌群构成情况:采用16S rDNA基因测序检测各组大鼠粪便中菌群的构成情况;b.对比研脾虚大鼠肠道差异代谢产物情况:采用GC-MS检测各组大鼠结肠代谢产物情况;c.分析菌群与代谢产物的相关性:通过Pearson系数分析肠道菌群结构和代谢产物的相关变化;d.基于KEGG数据库对差异代谢物进行代谢通路富集分析。（3）对比研究脾虚大鼠线粒体氧化磷酸化功能:a.提取结肠线粒体,采用比色法检测线粒体脂肪酸β-氧化速率;b采用比色法检测各组线粒体呼吸链复合体Ⅰ-V活性c采用比色法检测ATP产生情况。（4）对比研究脾虚大鼠结肠AQPs的表达情况及其AC/cAMP/PKA调控机制:a.采用Western blot法检测结肠组织中AC、cAMP、PKA蛋白表达情况;b.采用ELISA方法检测大鼠结肠中AQP3、AQP4和AQP8含量。2.2.4统计方法采用SPSS20.0统计软件进行分析,符合正态分布的数据采用均值±标准差（x±s）表示,两两比较根据方差齐性检验结果采用LSD。不符合正态分布的数据采用中位数和平均秩进行统计描述,用非参数检验分析不同组之间的差异性。所有检验均一双侧检验作为显著性水准,P＜0.05说明两者差异具有统计学意义,P＜0.01说明两者差异极其显著,P＞0.05尚不能认为有差异。3研究结果实验一长夏季节脾虚型大鼠水液代谢宏观指标的研究与BLANK组相比较,MODEL1组、MODEL2组大鼠均出现了体重减轻和便形质软甚至稀溏的典型脾虚表现,各样本评分均在5分及以上,造模成功。粪便含水率MODEL1组无明显变化,MODEL2组升高,差异有统计学意义（P＜0.05）;结肠含水率MODEL1组和MODEL2组均表现为下降,且差异极其显著（P＜0.01）。首粒黑便时间与BLANK组相比,MODEL1组和MODEL2组均呈现出下降趋势,但无明显统计学意义。实验二长夏季节脾虚型大鼠肠道菌群表达水平差异性及代谢产物的研究与BLANK组相比较,MODEL1组、MODEL2组菌群结构差异,发现脾虚模型肠道菌群结构发生明显变化,复杂度出现下降趋势,同时在门水平上,拟杆菌门占比增加,厚壁菌门占比减少,F/B值下降。与BLANK组相比,MODEL1组和代谢产物发生明显变化,其中有机酸甲酸类含量降低（P＜0.05）;乙酸类含量升高（P＜0.05）;丙酸类含量降低（P＜0.05）;丁酸类含量升高（P＜0.05）。脂肪酸及其衍生物中短链脂肪酸衍生物含量降低（P＜0.05）,长链脂肪酸衍生物:壬二酸（Azelaicacid）含量降低（P＜0.05）,顺式刚烯二酸（Cis-gondoicacid）、2-羟基十一酸酯（2-hydroxyundecanoate）含量升高（P＜0.05）;与 BLANK组相比,MODEL2组和代谢产物发生明显变化,其中有机酸甲酸类含量降低（P＜0.05）;乙酸类:乙醇酸（Glycolicacid）、4-羟基苯乙酸（4-hydroxybenzeneaceticacid）、四氧乙酸（Alloxanoicacid）含量降低（P＜0.05）,3-羟基苯乙酸（3-hydroxyphenylaceticacid）含量升高（P＜0.05）;丙酸类含量降低（P＜0.05）;丁酸类含量升高（P＜0.05）;戊酸类:5-氨基戊酸（5-aminovalericacid）含量降低（P＜0.05）,L-2-羟基戊二酸（L-2-hydroxyglutaricacid）含量升高（P＜0.05）。脂肪酸及其衍生物中短链脂肪酸衍生物:5-羟基戊酸（5-hydroxypentanoicacid）含量降低（P＜0.05）,柠檬酸（Citraconic acid）含量升高（P＜0.05）;长链脂肪酸衍生物:2-辛烯酸（2-octenoicacid）含量降低（P＜0.05）,顺式刚烯二酸（Cis-gondoic acid）含量升高（P＜0.05）。通过差异代谢通路富集分析发现,与BLANK组相比,MODEL 1组和MODEL2组差异代谢通路差异性最大的是cAMP信号通路,活性异常增高,且MODEL1组和MODEL2组cAMP信号通路活性差异极其显著（P＜0.01）。实验三长夏季节脾虚型大鼠结肠细胞氧化磷酸化功能的研究与BLANK组相比,MODEL1组和MODEL2组肠道细胞线粒体脂肪酸β-氧化速率显著降低（P＜0.01）。与BLANK组相比,MODEL1组肠道细胞线粒体呼吸链复合体Ⅰ无明显变化（P＞0.05）,呼吸链复合体Ⅱ、Ⅳ、V显著降低（P＜0.01）,呼吸链复合体Ⅲ显著升高（P＜0.01）;与BLANK组相比,MODEL2组肠道细胞线粒体呼吸链复合体Ⅰ、Ⅱ无明显变化（P＞0.05）,呼吸链复合体Ⅲ显著升高（P＜0.01）,呼吸链复合体Ⅳ、V显著降低（P＜0.01）。与BLANK组相比,MODEL1组和MODEL2组肠道细胞线粒体ATP含量显著降低（P＜0.01）。实验四长夏季节脾虚型大鼠肠道AC/cAMP/PKA途径及水通道蛋白表达情况的研究与BLANK组相比,MODEL1组和MODEL2组AC蛋白表达水平显著增高（P＜0.01）,cAMP蛋白表达水平显著增高（P＜0.01）,PKA蛋白表达水平显著增高（P＜0.01）。与BLANK组相比,MODEL1组和MODEL2组AQP3蛋白表达水平显著增高（P＜0.01）,AQP4蛋白表达水平显著降低（P＜0.01）,AQP8蛋白表达水平显著降低（P＜0.01）。4研究结论4.1理论研究提出研究假说:长夏季节,脾虚证状态下,机体肠道菌群结构不能同生理状态变化保持一致,参与代谢短链脂肪酸的菌群结构异常,影响了线粒体脂肪酸β-氧化和ATP产生,从而通过AC/cAMP/PKA途径对肠道AQPs的调控,导致AQP3表达上调,AQP4、AQP8表达下调,肠道水分重吸收障碍而引发泄泻。4.2实验研究（1）长夏脾虚大鼠宏观上表现为肠道水液代谢功能障碍以及肠道传导功能加快的趋势;（2）长夏脾虚大鼠肠道菌群结构会发生紊乱,厚壁菌门占比下降,拟杆菌门占比升高;同时伴随短链脂肪酸代谢异常导致的cAMP信号通路异常活化;（3）肠道菌群及其代谢产物的异常变化可以引起肠道线粒体脂肪酸β-氧化速率和氧化磷酸化水平下降,干预肠道能量代谢;（4）长夏脾虚泄泻的发生机制与能量代谢异常引发内在AC/cAMP/PKA对肠道AQPs的异常调节有关。