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肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)是我国最常见的恶性肿瘤之一，发病率和死亡率均较高。肝癌的外科手术治疗是肝癌病人获得长期生存最重要的手段之一，但患者行肝癌切除术后5年肿瘤复发转移率却高达40%～70%。发现和利用与HCC进展和预后相关的分子，有助于更准确更快速的判断患者病情和预后。
CTHRC1(Collagen triple helix repeat containing 1)是一种分泌蛋白，它参与多个生物学过程，如增加细胞迁移能力、促进血管和组织修复过程、预防肝纤维化和瘢痕形成、骨形成和骨重塑等。CTHRC1可作为一种致癌基因与多种人类癌症发生相关。然而，CTHRC1在HCC发生发展过程中的临床意义尚不清楚，亟待进一步研究。
Hsa-miR-30b定位于人染色体8q24上，是miR-30家族的一员，通过与多种靶基因相互作用而发挥其功能。miR-30b参与癌症的侵袭与迁移、细胞周期调节等多个生物学过程。HCC中CTHRC1是否是miR-30b的靶点，以及CTHRC1在HCC发展、转移中所发挥的作用及具体机制目前尚未研究透彻。
在肿瘤转移过程中，上皮细胞来源的恶性肿瘤细胞必须首先获得迁移和侵袭能力才能自原发性位置进入循环系统。上皮间充质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)是上皮来源恶性肿瘤具备迁移性和侵袭性的重要原因。在EMT过程中，E-钙粘蛋白等上皮表型标志物分子表达减少，而间质表型标志物分子N-钙粘蛋白，波形蛋白等表达增加。E-钙粘蛋白是肿瘤细胞维持上皮细胞表型的重要因素，其表达下调或缺失是EMT转化的显著特征。既往HCC基因组学研究表明，在HCC发生发展的过程中，Wnt通路成员经常发生突变或发生拷贝数改变，超过44%的HCC样本中有Wnt信号轴的基因改变。Wnt通路成员发生基因突变常能促使恶性肿瘤细胞发生上皮间质转化。但CTHRC1是否可以通过Wnt通路诱导EMT的发生仍不清楚。
本研究拟通过收集肝癌患者的癌及癌旁组织，血液标本，并开展细胞学和动物学实验，(1)观察CTHRC1的表达在肝癌中的临床意义及预后价值，为肿瘤的预后提供新的线索。(2)通过体外实验验证，miR-30b与CTHRC1相互作用及其对肝癌细胞生物活性的影响及其相关机制，并为下一步的动物实验提供基础。(3)通过荷瘤裸鼠模型研究miR-30b靶向CTHRC1在体内环境对肝癌细胞的抑制作用。本研究分为以下三部分：
第一部分CTHRC1在肝细胞癌组织、肝细胞癌患者血清及血细胞中的表达水平及其与临床病理特征的关系
目的：
检测CTHRC1在肝细胞癌组织、肝细胞癌患者血清及血细胞中的表达，并分析其与临床病理因素及预后的关系。
方法：
收集2015年9月至2018年9月在中国人民解放军联勤保障部队第980医院进行肝癌外科手术的29例HCC患者的石蜡包埋病理标本；2019年3月至2019年5月在中国人民解放军联勤保障部队第980医院就诊的肝癌患者的血清及血细胞；2019年3月至2019年5月在中国人民解放军联勤保障部队第980医院体检中心体检的正常人血清及血细胞。应用免疫组织化学染色、血液总RNA提取、逆转录定量PCR(qRT-PCR)、ELISA等方法，对收集的肝癌组织及相应的癌旁组织、血清及血细胞中的CTHRC1蛋白和mRNA表达水平进行检测，观察其与临床病理因素及预后的关系。
结果：
1.CTHRC1在Oncomine数据库HCC标本中高表达
通过来自Oncomine数据库的281个独立分析，分析CTHRC1在癌组织和正常组织中的表达。281个独立分析中有66项符合下列条件：①肿瘤组织的基因表达量是正常组织的两倍，②基因排位位于前10%和③P=0.0001。有2个HCC独立分析符合这些条件。
通过对从Oncomine数据库获得的四项独立数据分析亦可知，CTHRC1在HCC组织与正常组织中的表达情况。根据GuichardLiver(对比分析1)、GuichardLiver2(对比分析2)、TheCancerGenomeAtlasLiver(对比分析3)和WurmbachLiver(对比分析4)，上述分析中CTHRC1的中位秩排序为938.5。根据中位秩分析，CTHRC1的P值为1.29E-13。在四项分析中，WurmbachLiver分析中，CTHRC1基因表达量最高。在WurmbachLiver分析中，观察25681_at探针的数据，HCC与正常组比较，差异有统计学意义(P＜0.001)。
对基因拷贝数进行分析的结果显示：根据TheCancerGenomeAtlasLiver和GuichardLiver分析，HCC组织中CTHRC1基因拷贝数较正常肝组织增加。此外，在WurmbachLiver分析中观察到HCC组织中，CTHRC1的mRNA水平较正常组织上调了11.156倍，基因表达排序为67位(前1%)。这些结果提示CTHRC1在HCC组织中高表达。
2.CTHRC1在HCC组织中高表达
通过免疫组织化学的方法评价CTHRC1在人HCC组织中的水平和分布，以此来分析其在HCC中的临床相关性。分析的结果显示，来自29例患者的病理样本中均能观察到CTHRC1表达，其中，弱阳性7例、阳性11例、强阳性11例；对应的29例癌旁组织中，12例为阴性，13例为弱阳性，1例为阳性，3例为强阳性。CTHRC1在HCC组织中的表达显著高于癌旁组织(P＜0.001)。
3.CTHRC1在肝癌细胞系中高表达
对肝癌细胞系进行qRT-PCR检测的结果显示，CTHRC1mRNA在Huh7、HepG2、SMMC7721细胞中较LO2、QSG7701细胞存在高表达。结果表明，肝癌细胞系中CTHRC1mRNA的表达水平明显高于正常肝细胞系(P＜0.01)。
4.CTHRC1在HCC患者血清中高表达
酶联免疫吸附测定结果显示，CTHRC1在HCC血清中的表达水平较正常对照组高，差异有显著意义(P=0.039)。
5.CTHRC1在HCC患者血细胞中高表达
qRT-PCR结果显示，CTHRC1mRNA在HCC患者血细胞中的表达水平为正常对照组的2-9倍。
6.在HCC中，CTHRC1高表达与预后不良相关
统计分析结果显示，CTHRC1表达水平与肝硬化、肿瘤大小、血管浸润、TNM分期、BCLC分期显著相关(P＜0.05)。然而，CTHRC1的表达水平与包括性别、年龄、甲胎蛋白、谷氨酰转肽酶、丙氨酸氨基转移酶、乙型肝炎病毒感染和肿瘤数量在内的其他临床病理特征不相关。HCC患者生存曲线显示，CTHRC1高表达可能与预后不良相关。
7.CTHRC1可作为HCC预后相关的生物标志物
来自GeneExpressionProfilingInteractiveAnalysis数据库的分析结果显示，369例HCC患者中CTHRC1的表达水平明显高于160例正常组织。进一步分析的结果显示，CTHRC1高表达可能与预后不良有关。以上结果表明，CTHRC1可作为HCC的生物标志物。
小结：
1.CTHRC1在Oncomine数据库HCC样本中高表达。
2.CTHRC1在肝细胞癌组织中、细胞系中、HCC患者血清中、HCC患者血细胞中高表达。CTHRC1在肝细胞癌组织中的高表达与肝硬化、肿瘤大小、血管浸润、TNM分期、BCLC分期显著相关。
3.在肝细胞癌中，CTHRC1的高表达与预后不良相关，CTHRC1可作为肝细胞癌预后的生物标志物。
第二部分过表达CTHRC1的人肝癌细胞株的构建及miR-30b与CTH-RC1的关系探讨
目的：
构建CTHRC1过表达的人肝癌细胞株，为后续研究miR-30b与CTHRC1在肝癌增殖、迁移等过程中的生物学作用及相互关系提供细胞模型。
方法：
应用生物信息学工具预测miR-30b的靶基因，利用细胞瞬时转染、qRT-PCR、蛋白免疫印迹试验等方法初步验证miR-30b与CTHRC1在293T细胞中的表达水平，并观察miR-30b在不同肝癌细胞系中的表达。利用慢病毒基因传递系统建立CTHRC1稳定过表达的肝癌细胞株，为研究miR-30b与CTHRC1相互作用以及二者在肝癌细胞增殖、迁移等过程中的作用提供理论基础，并为下一步的动物实验提供物质基础。
结果：
1.CTHRC1与miR-30b的靶关系预测
通过TargetScan数据库(更新至2018年3月)检索miR-30b的基本信息，分别在miRDB、mirDIP和miRTarBase三个数据库中对miR-30b的潜在靶基因进行预测，均能预测到CTHRC1可能为miR-30b的靶基因。
2.肝癌细胞中miR-30b表达下降，CTHRC1表达升高
应用qRT-PCR检测3种不同肝癌细胞系中miR-30b的表达，表达量由低到高依次为SMMC7721、HepG2、Huh7，显著低于对照组正常人肝细胞LO2、QSG7701(P＜0.01)。与第一部分实验结果中CTHRC1在这三种细胞系中的表达水平相反。
3.CTHRC1与miR-30b表达水平相互作用关系分析
构建pCTHRC1-IRES2-EGFP质粒，瞬时转染至293T细胞，探讨CTHRC1与miR-30b的相互作用关系。结果表明，与对照组相比，转染miR-30bmimics及pCTHRC1-IRES2-EGFP质粒能够显著提高细胞内miR-30b及CTHRC1的表达水平(t=9.96，t=25.238，P值均＜0.05)。在293T细胞中，过表达CTHRC1组中，miR-30b的表达水平显著下降(t=－3.457，P＜0.05)。而过表达miR-30b能够使CTHRC1表达水平显著下降(t=－24.677，P＜0.05)。
4.慢病毒上清的制备
委托上海生工公司构建重组载体pLV-CTHRC1，测序正确后转染至293T细胞。qRT-PCR检测结果显示，转染后的细胞内CTHRC1基因表达显著上升。CTHRC1过表达质粒构建成功。进一步行慢病毒包装及滴度检测。
5.计算嘌呤霉素筛选的最佳浓度
计算在拟感染细胞Huh7及HepG2的嘌呤霉素筛选最佳浓度，细胞活力检测结果表明，0.6ug/ml的嘌呤霉素可使Huh7及HepG2的细胞活力明显下降，可作为药物筛选的最佳浓度。
6.qRT-PCR检测稳转细胞株，CTHRC1表达升高
病毒上清感染Huh7及HepG2后，添加0.6ug/ml嘌呤霉素对细胞进行筛选，用qRT-PCR的方法检测细胞内的CTHRC1的表达，与对照组相比，CTHRC1基因有显著过表达效果，证明稳转细胞株构建成功。
小结：
1.应用生物信息学软件预知CTHRC1可能作为miR-30b的靶基因；pCTHRC1-IRES2-EGFP质粒瞬时转染293T细胞的结果显示，CTHRC1与miR-30b在细胞内的表达呈相反趋势；在肝癌细胞中CTHRC1与miR-30b的表达亦呈相反趋势。据此，可推测出miR-30b可结合于CTHRC1mRNA3UTR区，从而抑制其表达。
2.通过慢病毒基因传递系统，用含有CTHRC1基因的慢病毒感染Huh7及HepG2细胞，筛选稳转细胞株。qRT-PCR验证结果表明，成功构建了稳定高效过表达CTHRC1的肝癌Huh7及HepG2细胞株，为下一步研究CTHRC1基因对肝癌细胞增殖、迁移的影响提供细胞模型。
第三部分miR-30b靶向CTHRC1参与调控肝癌细胞的增殖、迁移、细胞周期调节等生物学行为及其可能的分子机制
目的：
通过体内及体外实验，进一步探讨CTHRC1在肝癌细胞增殖、迁移、细胞周期中的作用，对EMT相关蛋白、Wnt通路蛋白的表达的影响，以及miR-30b对CTHRC1的调控作用。
方法：
通过细胞增殖实验、划痕实验、细胞周期检测、免疫组织化学染色、Westernblot及小动物活体成像等方法探究miR-30b及CTHRC1在肝癌细胞增殖、迁移、细胞周期的作用及其对EMT相关蛋白和Wnt通路蛋白的表达的影响，进一步探讨miR-30b靶向CTHRC1在肝癌进程中发挥的作用及调控机制。
结果：
1.MiR-30b显著减弱了CTHRC1对Huh7及HepG2的促增殖作用
Huh7及HepG2细胞均分为四组：对照组、LV-CTHRC1组、miR-30bmimics组、miR-30bmimics+LV-CTHRC1组。CCK-8实验的结果显示，在培养72h后，LV-CTHRC1组的细胞增殖能力显著高于对照组(P＜0.01)。相反，miR-30bmimics组的细胞增殖能力显著低于对照组(P＜0.01)。而miR-30bmimics+LV-CTHRC1组的细胞增殖能力显著低于LV-CTHRC1组(P＜0.05)。以上结果表明，过表达CTHRC1可增加肝癌细胞增殖能力，而miR-30b显著减弱了CTHRC1对Huh7及HepG2的促增殖作用。
2.MiR-30b显著抑制了CTHRC1对肝癌细胞Huh7及HepG2的促迁移作用
划痕实验结果显示，划痕后48h，LV-CTHRC1组的细胞划痕愈合率显著高于对照组(P＜0.001)。相反，miR-30bmimics组的细胞划痕愈合率显著低于对照组(P＜0.001)。而miR-30bmimics+LV-CTHRC1组的细胞划痕愈合率显著低于LV-CTHRC1组(P＜0.001)。以上结果表明，过表达CTHRC1可增加肝癌细胞迁移能力，而miR-30b显著抑制了CTHRC1对肝癌细胞Huh7及HepG2的促迁移作用。
3.MiR-30b对肝癌细胞HepG2的细胞周期有G2/M阻滞作用
细胞周期检测结果显示，对照组、LV-CTHRC1组、miR-30bmimics+LV-CTHRC1组、miR-30bmimics组G1期细胞比例分别为：81%、66%、61%、58%；G2/M期细胞比例分别为：7.75%、19.8%、24.5%、30.8%。实验组与对照组比较，差异有显著意义，P＜0.01。提示miR-30b对肝癌细胞HepG2的细胞周期有G2/M阻滞作用。
4.MiR-30b抑制了CTHRC1对EMT及Wnt通路的促进作用
为探讨CTHRC1在EMT过程中及Wnt通路中发挥的作用及miR-30b对CTHRC1的抑制作用，本实验应用免疫组织化学染色的方法检测病理标本中E-cadherin、Vimentin、β-catenin的表达。应用Westernblot检测肝癌细胞中CTHRC1、E-cadherin、Vimentin及β-catenin的表达情况。
免疫组化结果显示，在组织中，E-cadherin阳性定位于细胞膜，E-cadherin在肝细胞癌组织和癌旁组织中阳性表达率分别为34.5%(10/29)和100%(29/29)，差异有显著意义，P＜0.05。vimentin阳性定位于细胞质，Vimentin在肝癌组织中阳性表达率为100%(29/29)，而在癌旁组织中不表达。β-catenin阳性定位于细胞质，β-catenin在肝细胞癌组织和癌旁组织中阳性表达率分别为62.1%(18/29)和17.2%(5/29)，差异有显著意义，P＜0.05。
Westernblot检测结果显示，LV-CTHRC1组中CTHRC1、vimentin、β-catenin的表达均显著高于Huh7对照组(P＜0.05)；相反，E-cadherin表达显著低于Huh7对照组(P＜0.05)。miR-30bmimics组CTHRC1、vimentin、β-catenin与Huh7对照组比较差异无显著意义，但与LV-CTHRC1组比较表达均降低。E-cadherin在miR-30bmimics组中的表达显著高于LV-CTHRC1组(P＜0.05)。以上结果表明，miR-30b抑制了CTHRC1对EMT的促进作用，可能是通过Wnt/β-catenin信号通路发挥的作用。
5.MiR-30b可以减弱CTHRC1对肝癌细胞的成瘤作用
采用皮下注射的方法，将不同处理组的Huh7细胞种植到裸鼠体内，miR-30bmimics组未成瘤，余三组Huh7对照组、LV-CTHRC1组、miR-30bmimics+LV-CTHRC1组待成瘤后，每4d测量小鼠移植瘤体积。实验结果表明：在种植后24d，与对照组相比，LV-CTHRC1组移植瘤体积显著增加(P＜0.001)；miR-30bmimics+LV-CTHRC1组移植瘤的体积显著受到抑制，与LV-CTHRC1组或对照组比较，差异均有显著意义(P＜0.01)。剥离瘤体称重，结果显示，对照组、LV-CTHRC1组、miR-30bmimics+LV-CTHRC1组平均瘤重分别为0.09g、2.4g、0.97g，与对照组比较，差异有显著意义(P＜0.01)。说明miR-30b可以减弱CTHRC1对肝癌细胞Huh7的成瘤作用。
小结：
1.MiR-30b显著减弱了CTHRC1对Huh7及HepG2的促增殖作用。
2.MiR-30b显著抑制了CTHRC1对肝癌细胞Huh7及HepG2的促迁移作用。
3.MiR-30b对肝癌细胞HepG2的细胞周期有G2/M阻滞作用。
4.MiR-30b抑制了CTHRC1对EMT及Wnt通路的促进作用。
5.MiR-30b可以减弱CTHRC1对肝癌细胞的成瘤作用。
结论：
1.CTHRC1在肝细胞癌组织、肝细胞癌患者血清及血细胞中均高表达，其高表达与肝硬化、肿瘤大小、血管浸润、TNM分期、BCLC分期显著相关。
2.CTHRC1可作为肝细胞癌预后的生物标志物。
3.MiR-30b可结合于CTHRC1mRNA3UTR区，从而抑制其表达。
4.MiR-30b靶向CTHRC1可抑制肝癌细胞的增殖、迁移，引起肝癌细胞周期阻滞。
5.MiR-30b抑制了CTHRC1对EMT及Wnt通路的促进作用。
6.MiR-30b可以减弱CTHRC1对肝癌细胞Huh7的成瘤作用。
CTHRC1(Collagen triple helix repeat containing 1)是一种分泌蛋白，它参与多个生物学过程，如增加细胞迁移能力、促进血管和组织修复过程、预防肝纤维化和瘢痕形成、骨形成和骨重塑等。CTHRC1可作为一种致癌基因与多种人类癌症发生相关。然而，CTHRC1在HCC发生发展过程中的临床意义尚不清楚，亟待进一步研究。
Hsa-miR-30b定位于人染色体8q24上，是miR-30家族的一员，通过与多种靶基因相互作用而发挥其功能。miR-30b参与癌症的侵袭与迁移、细胞周期调节等多个生物学过程。HCC中CTHRC1是否是miR-30b的靶点，以及CTHRC1在HCC发展、转移中所发挥的作用及具体机制目前尚未研究透彻。
在肿瘤转移过程中，上皮细胞来源的恶性肿瘤细胞必须首先获得迁移和侵袭能力才能自原发性位置进入循环系统。上皮间充质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)是上皮来源恶性肿瘤具备迁移性和侵袭性的重要原因。在EMT过程中，E-钙粘蛋白等上皮表型标志物分子表达减少，而间质表型标志物分子N-钙粘蛋白，波形蛋白等表达增加。E-钙粘蛋白是肿瘤细胞维持上皮细胞表型的重要因素，其表达下调或缺失是EMT转化的显著特征。既往HCC基因组学研究表明，在HCC发生发展的过程中，Wnt通路成员经常发生突变或发生拷贝数改变，超过44%的HCC样本中有Wnt信号轴的基因改变。Wnt通路成员发生基因突变常能促使恶性肿瘤细胞发生上皮间质转化。但CTHRC1是否可以通过Wnt通路诱导EMT的发生仍不清楚。
本研究拟通过收集肝癌患者的癌及癌旁组织，血液标本，并开展细胞学和动物学实验，(1)观察CTHRC1的表达在肝癌中的临床意义及预后价值，为肿瘤的预后提供新的线索。(2)通过体外实验验证，miR-30b与CTHRC1相互作用及其对肝癌细胞生物活性的影响及其相关机制，并为下一步的动物实验提供基础。(3)通过荷瘤裸鼠模型研究miR-30b靶向CTHRC1在体内环境对肝癌细胞的抑制作用。本研究分为以下三部分：
第一部分CTHRC1在肝细胞癌组织、肝细胞癌患者血清及血细胞中的表达水平及其与临床病理特征的关系
目的：
检测CTHRC1在肝细胞癌组织、肝细胞癌患者血清及血细胞中的表达，并分析其与临床病理因素及预后的关系。
方法：
收集2015年9月至2018年9月在中国人民解放军联勤保障部队第980医院进行肝癌外科手术的29例HCC患者的石蜡包埋病理标本；2019年3月至2019年5月在中国人民解放军联勤保障部队第980医院就诊的肝癌患者的血清及血细胞；2019年3月至2019年5月在中国人民解放军联勤保障部队第980医院体检中心体检的正常人血清及血细胞。应用免疫组织化学染色、血液总RNA提取、逆转录定量PCR(qRT-PCR)、ELISA等方法，对收集的肝癌组织及相应的癌旁组织、血清及血细胞中的CTHRC1蛋白和mRNA表达水平进行检测，观察其与临床病理因素及预后的关系。
结果：
1.CTHRC1在Oncomine数据库HCC标本中高表达
通过来自Oncomine数据库的281个独立分析，分析CTHRC1在癌组织和正常组织中的表达。281个独立分析中有66项符合下列条件：①肿瘤组织的基因表达量是正常组织的两倍，②基因排位位于前10%和③P=0.0001。有2个HCC独立分析符合这些条件。
通过对从Oncomine数据库获得的四项独立数据分析亦可知，CTHRC1在HCC组织与正常组织中的表达情况。根据GuichardLiver(对比分析1)、GuichardLiver2(对比分析2)、TheCancerGenomeAtlasLiver(对比分析3)和WurmbachLiver(对比分析4)，上述分析中CTHRC1的中位秩排序为938.5。根据中位秩分析，CTHRC1的P值为1.29E-13。在四项分析中，WurmbachLiver分析中，CTHRC1基因表达量最高。在WurmbachLiver分析中，观察25681_at探针的数据，HCC与正常组比较，差异有统计学意义(P＜0.001)。
对基因拷贝数进行分析的结果显示：根据TheCancerGenomeAtlasLiver和GuichardLiver分析，HCC组织中CTHRC1基因拷贝数较正常肝组织增加。此外，在WurmbachLiver分析中观察到HCC组织中，CTHRC1的mRNA水平较正常组织上调了11.156倍，基因表达排序为67位(前1%)。这些结果提示CTHRC1在HCC组织中高表达。
2.CTHRC1在HCC组织中高表达
通过免疫组织化学的方法评价CTHRC1在人HCC组织中的水平和分布，以此来分析其在HCC中的临床相关性。分析的结果显示，来自29例患者的病理样本中均能观察到CTHRC1表达，其中，弱阳性7例、阳性11例、强阳性11例；对应的29例癌旁组织中，12例为阴性，13例为弱阳性，1例为阳性，3例为强阳性。CTHRC1在HCC组织中的表达显著高于癌旁组织(P＜0.001)。
3.CTHRC1在肝癌细胞系中高表达
对肝癌细胞系进行qRT-PCR检测的结果显示，CTHRC1mRNA在Huh7、HepG2、SMMC7721细胞中较LO2、QSG7701细胞存在高表达。结果表明，肝癌细胞系中CTHRC1mRNA的表达水平明显高于正常肝细胞系(P＜0.01)。
4.CTHRC1在HCC患者血清中高表达
酶联免疫吸附测定结果显示，CTHRC1在HCC血清中的表达水平较正常对照组高，差异有显著意义(P=0.039)。
5.CTHRC1在HCC患者血细胞中高表达
qRT-PCR结果显示，CTHRC1mRNA在HCC患者血细胞中的表达水平为正常对照组的2-9倍。
6.在HCC中，CTHRC1高表达与预后不良相关
统计分析结果显示，CTHRC1表达水平与肝硬化、肿瘤大小、血管浸润、TNM分期、BCLC分期显著相关(P＜0.05)。然而，CTHRC1的表达水平与包括性别、年龄、甲胎蛋白、谷氨酰转肽酶、丙氨酸氨基转移酶、乙型肝炎病毒感染和肿瘤数量在内的其他临床病理特征不相关。HCC患者生存曲线显示，CTHRC1高表达可能与预后不良相关。
7.CTHRC1可作为HCC预后相关的生物标志物
来自GeneExpressionProfilingInteractiveAnalysis数据库的分析结果显示，369例HCC患者中CTHRC1的表达水平明显高于160例正常组织。进一步分析的结果显示，CTHRC1高表达可能与预后不良有关。以上结果表明，CTHRC1可作为HCC的生物标志物。
小结：
1.CTHRC1在Oncomine数据库HCC样本中高表达。
2.CTHRC1在肝细胞癌组织中、细胞系中、HCC患者血清中、HCC患者血细胞中高表达。CTHRC1在肝细胞癌组织中的高表达与肝硬化、肿瘤大小、血管浸润、TNM分期、BCLC分期显著相关。
3.在肝细胞癌中，CTHRC1的高表达与预后不良相关，CTHRC1可作为肝细胞癌预后的生物标志物。
第二部分过表达CTHRC1的人肝癌细胞株的构建及miR-30b与CTH-RC1的关系探讨
目的：
构建CTHRC1过表达的人肝癌细胞株，为后续研究miR-30b与CTHRC1在肝癌增殖、迁移等过程中的生物学作用及相互关系提供细胞模型。
方法：
应用生物信息学工具预测miR-30b的靶基因，利用细胞瞬时转染、qRT-PCR、蛋白免疫印迹试验等方法初步验证miR-30b与CTHRC1在293T细胞中的表达水平，并观察miR-30b在不同肝癌细胞系中的表达。利用慢病毒基因传递系统建立CTHRC1稳定过表达的肝癌细胞株，为研究miR-30b与CTHRC1相互作用以及二者在肝癌细胞增殖、迁移等过程中的作用提供理论基础，并为下一步的动物实验提供物质基础。
结果：
1.CTHRC1与miR-30b的靶关系预测
通过TargetScan数据库(更新至2018年3月)检索miR-30b的基本信息，分别在miRDB、mirDIP和miRTarBase三个数据库中对miR-30b的潜在靶基因进行预测，均能预测到CTHRC1可能为miR-30b的靶基因。
2.肝癌细胞中miR-30b表达下降，CTHRC1表达升高
应用qRT-PCR检测3种不同肝癌细胞系中miR-30b的表达，表达量由低到高依次为SMMC7721、HepG2、Huh7，显著低于对照组正常人肝细胞LO2、QSG7701(P＜0.01)。与第一部分实验结果中CTHRC1在这三种细胞系中的表达水平相反。
3.CTHRC1与miR-30b表达水平相互作用关系分析
构建pCTHRC1-IRES2-EGFP质粒，瞬时转染至293T细胞，探讨CTHRC1与miR-30b的相互作用关系。结果表明，与对照组相比，转染miR-30bmimics及pCTHRC1-IRES2-EGFP质粒能够显著提高细胞内miR-30b及CTHRC1的表达水平(t=9.96，t=25.238，P值均＜0.05)。在293T细胞中，过表达CTHRC1组中，miR-30b的表达水平显著下降(t=－3.457，P＜0.05)。而过表达miR-30b能够使CTHRC1表达水平显著下降(t=－24.677，P＜0.05)。
4.慢病毒上清的制备
委托上海生工公司构建重组载体pLV-CTHRC1，测序正确后转染至293T细胞。qRT-PCR检测结果显示，转染后的细胞内CTHRC1基因表达显著上升。CTHRC1过表达质粒构建成功。进一步行慢病毒包装及滴度检测。
5.计算嘌呤霉素筛选的最佳浓度
计算在拟感染细胞Huh7及HepG2的嘌呤霉素筛选最佳浓度，细胞活力检测结果表明，0.6ug/ml的嘌呤霉素可使Huh7及HepG2的细胞活力明显下降，可作为药物筛选的最佳浓度。
6.qRT-PCR检测稳转细胞株，CTHRC1表达升高
病毒上清感染Huh7及HepG2后，添加0.6ug/ml嘌呤霉素对细胞进行筛选，用qRT-PCR的方法检测细胞内的CTHRC1的表达，与对照组相比，CTHRC1基因有显著过表达效果，证明稳转细胞株构建成功。
小结：
1.应用生物信息学软件预知CTHRC1可能作为miR-30b的靶基因；pCTHRC1-IRES2-EGFP质粒瞬时转染293T细胞的结果显示，CTHRC1与miR-30b在细胞内的表达呈相反趋势；在肝癌细胞中CTHRC1与miR-30b的表达亦呈相反趋势。据此，可推测出miR-30b可结合于CTHRC1mRNA3UTR区，从而抑制其表达。
2.通过慢病毒基因传递系统，用含有CTHRC1基因的慢病毒感染Huh7及HepG2细胞，筛选稳转细胞株。qRT-PCR验证结果表明，成功构建了稳定高效过表达CTHRC1的肝癌Huh7及HepG2细胞株，为下一步研究CTHRC1基因对肝癌细胞增殖、迁移的影响提供细胞模型。
第三部分miR-30b靶向CTHRC1参与调控肝癌细胞的增殖、迁移、细胞周期调节等生物学行为及其可能的分子机制
目的：
通过体内及体外实验，进一步探讨CTHRC1在肝癌细胞增殖、迁移、细胞周期中的作用，对EMT相关蛋白、Wnt通路蛋白的表达的影响，以及miR-30b对CTHRC1的调控作用。
方法：
通过细胞增殖实验、划痕实验、细胞周期检测、免疫组织化学染色、Westernblot及小动物活体成像等方法探究miR-30b及CTHRC1在肝癌细胞增殖、迁移、细胞周期的作用及其对EMT相关蛋白和Wnt通路蛋白的表达的影响，进一步探讨miR-30b靶向CTHRC1在肝癌进程中发挥的作用及调控机制。
结果：
1.MiR-30b显著减弱了CTHRC1对Huh7及HepG2的促增殖作用
Huh7及HepG2细胞均分为四组：对照组、LV-CTHRC1组、miR-30bmimics组、miR-30bmimics+LV-CTHRC1组。CCK-8实验的结果显示，在培养72h后，LV-CTHRC1组的细胞增殖能力显著高于对照组(P＜0.01)。相反，miR-30bmimics组的细胞增殖能力显著低于对照组(P＜0.01)。而miR-30bmimics+LV-CTHRC1组的细胞增殖能力显著低于LV-CTHRC1组(P＜0.05)。以上结果表明，过表达CTHRC1可增加肝癌细胞增殖能力，而miR-30b显著减弱了CTHRC1对Huh7及HepG2的促增殖作用。
2.MiR-30b显著抑制了CTHRC1对肝癌细胞Huh7及HepG2的促迁移作用
划痕实验结果显示，划痕后48h，LV-CTHRC1组的细胞划痕愈合率显著高于对照组(P＜0.001)。相反，miR-30bmimics组的细胞划痕愈合率显著低于对照组(P＜0.001)。而miR-30bmimics+LV-CTHRC1组的细胞划痕愈合率显著低于LV-CTHRC1组(P＜0.001)。以上结果表明，过表达CTHRC1可增加肝癌细胞迁移能力，而miR-30b显著抑制了CTHRC1对肝癌细胞Huh7及HepG2的促迁移作用。
3.MiR-30b对肝癌细胞HepG2的细胞周期有G2/M阻滞作用
细胞周期检测结果显示，对照组、LV-CTHRC1组、miR-30bmimics+LV-CTHRC1组、miR-30bmimics组G1期细胞比例分别为：81%、66%、61%、58%；G2/M期细胞比例分别为：7.75%、19.8%、24.5%、30.8%。实验组与对照组比较，差异有显著意义，P＜0.01。提示miR-30b对肝癌细胞HepG2的细胞周期有G2/M阻滞作用。
4.MiR-30b抑制了CTHRC1对EMT及Wnt通路的促进作用
为探讨CTHRC1在EMT过程中及Wnt通路中发挥的作用及miR-30b对CTHRC1的抑制作用，本实验应用免疫组织化学染色的方法检测病理标本中E-cadherin、Vimentin、β-catenin的表达。应用Westernblot检测肝癌细胞中CTHRC1、E-cadherin、Vimentin及β-catenin的表达情况。
免疫组化结果显示，在组织中，E-cadherin阳性定位于细胞膜，E-cadherin在肝细胞癌组织和癌旁组织中阳性表达率分别为34.5%(10/29)和100%(29/29)，差异有显著意义，P＜0.05。vimentin阳性定位于细胞质，Vimentin在肝癌组织中阳性表达率为100%(29/29)，而在癌旁组织中不表达。β-catenin阳性定位于细胞质，β-catenin在肝细胞癌组织和癌旁组织中阳性表达率分别为62.1%(18/29)和17.2%(5/29)，差异有显著意义，P＜0.05。
Westernblot检测结果显示，LV-CTHRC1组中CTHRC1、vimentin、β-catenin的表达均显著高于Huh7对照组(P＜0.05)；相反，E-cadherin表达显著低于Huh7对照组(P＜0.05)。miR-30bmimics组CTHRC1、vimentin、β-catenin与Huh7对照组比较差异无显著意义，但与LV-CTHRC1组比较表达均降低。E-cadherin在miR-30bmimics组中的表达显著高于LV-CTHRC1组(P＜0.05)。以上结果表明，miR-30b抑制了CTHRC1对EMT的促进作用，可能是通过Wnt/β-catenin信号通路发挥的作用。
5.MiR-30b可以减弱CTHRC1对肝癌细胞的成瘤作用
采用皮下注射的方法，将不同处理组的Huh7细胞种植到裸鼠体内，miR-30bmimics组未成瘤，余三组Huh7对照组、LV-CTHRC1组、miR-30bmimics+LV-CTHRC1组待成瘤后，每4d测量小鼠移植瘤体积。实验结果表明：在种植后24d，与对照组相比，LV-CTHRC1组移植瘤体积显著增加(P＜0.001)；miR-30bmimics+LV-CTHRC1组移植瘤的体积显著受到抑制，与LV-CTHRC1组或对照组比较，差异均有显著意义(P＜0.01)。剥离瘤体称重，结果显示，对照组、LV-CTHRC1组、miR-30bmimics+LV-CTHRC1组平均瘤重分别为0.09g、2.4g、0.97g，与对照组比较，差异有显著意义(P＜0.01)。说明miR-30b可以减弱CTHRC1对肝癌细胞Huh7的成瘤作用。
小结：
1.MiR-30b显著减弱了CTHRC1对Huh7及HepG2的促增殖作用。
2.MiR-30b显著抑制了CTHRC1对肝癌细胞Huh7及HepG2的促迁移作用。
3.MiR-30b对肝癌细胞HepG2的细胞周期有G2/M阻滞作用。
4.MiR-30b抑制了CTHRC1对EMT及Wnt通路的促进作用。
5.MiR-30b可以减弱CTHRC1对肝癌细胞的成瘤作用。
结论：
1.CTHRC1在肝细胞癌组织、肝细胞癌患者血清及血细胞中均高表达，其高表达与肝硬化、肿瘤大小、血管浸润、TNM分期、BCLC分期显著相关。
2.CTHRC1可作为肝细胞癌预后的生物标志物。
3.MiR-30b可结合于CTHRC1mRNA3UTR区，从而抑制其表达。
4.MiR-30b靶向CTHRC1可抑制肝癌细胞的增殖、迁移，引起肝癌细胞周期阻滞。
5.MiR-30b抑制了CTHRC1对EMT及Wnt通路的促进作用。
6.MiR-30b可以减弱CTHRC1对肝癌细胞Huh7的成瘤作用。