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目的:多发性硬化造成患者中枢神经系统损伤机制目前尚不明确,氧化应激引起的神经元凋亡是目前研究的热点。线粒体是细胞内活性氧(ROS)的最主要的来源,线粒体抗氧化防御机制包括线粒体抗氧化物和解偶联抑制电子的还原。过氧化物酶体增殖物激活受体-γ共激活因子-1α(PGC-1α)是线粒体抗氧化物和解偶联蛋白(UCPs)转录共激活因子。我们通过研究PGC-1α在多发性硬化动物模型即实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)与体外实验中的功能,探索神经元中PGC-1α的上调是否可以通过调节多种线粒体抗氧化物如超氧化物歧化酶2(SOD2)、过氧化物氧化还原酶3(Prx3)、硫氧还蛋白2(Trx2)和解偶联蛋白(UCPs)的水平,从而影响氧化应激,导致神经元凋亡。方法:1.构建小鼠EAE模型,通过免疫荧光技术和Q-PCR技术评估正常组与疾病发生后13d,20d与30d的四组小鼠。检测小鼠大脑皮层和腰髓中PGC-1α的表达水平,以及腰髓中线粒体抗氧化物和UCPs表达水平的变化与疾病发展是否相关。2.构建在神经元中过表达PGC-1α(PGC-1α-TG)的转基因小鼠,并诱导EAE模型。(1)通过行为学评分、腰髓的HE染色、快蓝染色与髓磷脂碱性蛋白(MBP)免疫荧光染色方法来评价不同组小鼠的临床症状、炎性细胞浸润与中枢神经系统脱髓鞘率。(2)通过Tunel染色分析不同组小鼠腰髓神经元凋亡率,并通过WB检测Bax/Bcl2、cleaved caspase3蛋白的表达水平。(3)通过二氢乙啶(DHE)检测小鼠体内ROS水平反映两组小鼠体内氧化应激的水平。(4)通过Q-PCR检测小鼠腰髓中多种线粒体抗氧化物和UCPs表达。3.利用慢病毒转染分别构建PGC-1α过表达的神经元细胞系(NSC-34)LV-PGC-1α细胞和对照组LV-Ctrl细胞。利用大肠杆菌脂多糖(LPS)刺激模拟体内的炎症环境。(1)通过WB检测未经转染的NSC-34细胞在LPS刺激的时间点0h,3h,6h,12h,24h,48h PGC-1α蛋白水平的变化。(2)通过Tunel染色分析LPS刺激6h的LV-PGC-1α和LV-Ctrl细胞凋亡率并检测两组细胞的caspase3活性。使用MTS检测两组细胞的活力。(3)通过使用SOD活性试剂盒,MDA试剂盒和ROS试剂盒检测,两组细胞中SOD、甲烷二羧酸醛(MDA)含量和ROS的水平。(4)通过Q-PCR和免疫荧光技术检测两组细胞中多种线粒体抗氧化物和UCPs表达。4.通过RNA-seq序列分析实验组LV-PGC-1α细胞和对照组LV-Ctrl细胞在LPS环境刺激6h的差异基因,并对差异基因进行验证。(1)利用RNA-seq分析两组的差异基因,探索PGC-1α影响凋亡的潜在的靶基因和信号通路。(2)提取出生24h内的PGC-1α-TG转基因小鼠和WT小鼠的大脑皮层的原代神经元,使用LPS刺激6h后,通过Q-PCR检测两组中差异表达基因表达情况。结果:1.诱导EAE后,在第13天时,WT小鼠的PGC-1α的免疫荧光水平较对照组小鼠低,在第20天时,两组免疫荧光水平均降低,在第30天时两组免疫荧光水平均较前升高。Q-PCR结果显示PGC-1αmRNA表达趋势与免疫荧光结果基本一致。SOD2、Prx3、Trx2、UCP4和UCP5的mRNA与PGC-1α的变化趋势基本一致。UCP2的表达水平在不同时间点均无统计学意义的变化。2.1与对照组相比,PGC-1α-TG组小鼠的起始发病时间更晚,临床症状弱,临床评分低,中枢神经系统炎性细胞浸润程度更低以及脱髓鞘程度更弱。2.2与对照组WT小鼠相比,PGC-1α-TG小鼠神经元的凋亡比例更低,Bax/Bcl2蛋白表达水平的比值更低,cleaved caspase蛋白表达水平更低。2.3与对照组相比,PGC-1α-TG小鼠体内ROS的含量更低。2.4与对照组相比,PGC-1α-TG小鼠的线粒体抗氧化物SOD2、Prx3和Trx2以及UCPs的mRNA表达量更高。3.1利用LPS刺激后3h,NSC-34细胞中PGC-1α的蛋白表达水平降低,6h时短暂的上升,12h后又逐渐降低,48h时PGC-1α蛋白表达水平最低。3.2与LV-Ctrl细胞相比,LV-PGC-1α细胞凋亡率降低,caspase3活性降低,细胞活力更强。3.3与LV-Ctrl细胞相比,LV-PGC-1α细胞SOD含量上升,MDA含量下降,ROS水平下降。3.4与LVCtrl细胞相比,LV-PGC-1α细胞SOD2,Prx3,Trx2荧光强度更高,SOD2,Prx3,Trx2,UCP2,UCP4和UCP5的mRNA表达量更多。4.1 RNA-seq分析显示,在PGC-1α过表达组与对照组的差异表达基因的前10个重要GO条目中,凋亡相关的基因显著富集。4.2与对照组相比,PGC-1α-TG组小鼠大脑皮层的原代神经元中Txnip、Fas mRNA表达水平更低,而Bcl2、IGF1R mRNA表达水平更高。结论:在多发性硬化的动物模型和体外实验中,神经元中过表达PGC-1α可减少神经元凋亡和氧化应激的水平。PGC-1α保护神经凋亡的机制可能是通过调节抗氧化物和UCPs,减少氧化应激所导致的神经元损伤。基于此实验结果,PGC-1α是保护多发性性硬化中神经元损伤的潜在靶点。