背景：恶性黑色素瘤是一种常见的恶性肿瘤。早期恶性黑色素瘤通过手术切除，但近年其发病率有明显上升趋势。恶性黑色素瘤具有恶性程度高，转移发生早，累及多个脏器，预后较差，易复发，死亡率高等特点。目前，大多数患者对化疗、放疗均不敏感，生存期短。随着人们对肿瘤分子生物学机制深入研究，基因治疗肿瘤的方法取得了很大进步。利用RNA干涉(RNAinterference，RNAi)技术，有望特异高效地抑制目的基因表达，诱导肿瘤细胞发生凋亡，达到治疗肿瘤的目的。然而如何将目的基因安全、高效的运载到肿瘤组织内，是实现这一目的的瓶颈，近几年，纳米医学的迅速发展不仅为基因载体的研究提供新手段，而且为恶性肿瘤的诊断和治疗带来新的契机。因此，迫切需要开发更具有优异性能的纳米基因传递系统，更好地杀伤肿瘤细胞。近几年，一种极具应用前景和优异性能的新型纳米材料—石墨烯，以其独特的力学、电学、热学等理化性质引起了研究者极大的兴趣。功能化氧化石墨烯（Graphene Oxide, GO）被生物医学领域的研究者广泛应用。迄今，随着纳米技术的高速发展，越来越多的实验证明，经过表面修饰的GO可以提高基因的转染效率，在生理环境下稳定性好。聚乙烯亚胺（polythyleneimine, PEI）是目前应用较多的阳离子基因传递载体，在生理环境下表面带正电荷，与基因的结合能力强，保护基因免受核酸酶的降解，具有从内涵体逃逸的能力。聚乙二醇（PolyethyleneGlycol，PEG）修饰的氧化石墨烯可以提高GO-PEI稳定性和溶解性，延长复合物在体内的循环时间。所以本实验将采用GO-PEI-PEG反应形成的共聚物作为Stat3siRNA质粒的运载体。在信号转导通路中，信号转导子和转录激活子3（Signal transducer andactivator of transcription，Stat3）与肿瘤的发生发展密切相关。研究表明，在前列腺癌、肝癌及恶性黑色素瘤等多种肿瘤，Stat3呈现过度表达。Stat3的异常表达通过促进肿瘤新生血管的形成、抑制肿瘤细胞凋亡、促进肿瘤细胞增殖，参与肿瘤的发生过程。因此阻断肿瘤细胞中Stat3通路，可以达到治疗肿瘤的目的。在实验室前期工作中，以RNA干涉技术原理为基础，成功构建Stat3-特异siRNA表达质粒，抑制了前列腺癌、肝癌Stat3基因的过度表达[1,2]，促进肿瘤细胞凋亡。但是，RNAi并不能完全阻断目的基因的表达[3]。光热疗在物理学和生物学具有独特的的优势，与放疗、化疗相比，无毒副作用，具有杀伤肿瘤细胞的作用，可以作为治疗肿瘤的一种辅助手段。因此，光热疗和基因治疗联合策略治疗肿瘤迫在眉睫。本课题将氧化石墨烯、聚乙烯亚胺、聚乙二醇反应形成共聚物作为肿瘤基因Stat3-特异siRNA质粒的运载体，更好的抑制或杀死肿瘤细胞。同时利用氧化石墨烯吸收红外线的物理学性质，在红外线光照下引起肿瘤组织局部温度升高，从而杀伤肿瘤细胞，进一步探讨功能化氧化石墨烯携带Stat3-特异siRNA质粒对小鼠恶性黑色素瘤的治疗效果及作用机制。目的：功能化氧化石墨烯携带Stat3-特异siRNA表达质粒体内、体外抑制小鼠恶性黑色素瘤生长及作用机制的探讨。方法：采用化学法合成氧化石墨烯—聚乙烯亚胺—聚乙二醇（GO-PEI-PEG）基因载体。通过原子力学显微镜、动态光散射等方法，对GO-PEI-PEG粒径、形貌、表面电势等进行表征；研究GO-PEI-PEG在PBS溶液、血清和培养液中的分散性和稳定性。利用琼脂糖凝胶电泳方法，检测在不同质量比条件下，GO-PEI-PEG与si-Stat3结合能力。CCK8法检测GO-PEI-PEG对B16细胞毒性。流式细胞术评价GO-PEI-PEG运载si-Stat3质粒的转染效率。PI染色法检测肿瘤的细胞周期。RT-PCR和Western blot检测Stat3基因及蛋白表达水平；同时检测Stat3相关下游基因的表达情况。建立C57BL/6小鼠恶性黑色素瘤皮下移植瘤模型。透射电子显微镜观察凋亡细胞以及石墨烯的形貌；免疫组织化学方法检测CD34和PCNA的表达；TUNEL试剂盒检测肿瘤细胞凋亡情况；全自动生化分析仪检测各组小鼠血液中BUN、ALT和AST的水平；HE染色观察各组脏器的形态。结果：成功合成GO-PEI-PEG纳米材料，其表面电势为＋21.02mV，平均粒径为298.9nm，GO-PEI-PEG与si-Stat3质粒结合后形成的复合物，表面电势下降到＋7.52mV，平均粒径增大至339.2nm，在PBS溶液、血清和培养液中具有良好的分散性和稳定性。体外实验证明，GO-PEI-PEG是一种安全、有效的基因运载体，GO-PEI-PEG携带si-Stat3质粒转染B16细胞，能够观察到绿色荧光蛋白（GFP）的表达。Westernblot和RT-PCR结果显示，GO-PEI-PEG转染si-Stat3组细胞中Stat3基因被干涉，Stat3下游基因表达受到抑制。细胞周期结果显示，GO-PEI-PEG转染si-Stat3组肿瘤细胞周期阻滞在S期，阻止细胞周期的进程。体内实验证明，GO-PEI-PEG携带Stat3-siRNA质粒联合光照（简称GO-si-Stat3组）显著抑制小鼠恶性黑色素瘤的生长。GO-si-Stat3组的肿瘤瘤重和体积低于其他各组，具有统计学差异。在基因水平和蛋白水平，检测到GO-si-Stat3组Stat3表达受到抑制，Stat3下游调控基因和相关蛋白表达减弱。透射电镜和HE染色观察到凋亡细胞。免疫组织化学结果表明，GO-si-Stat3组增殖的肿瘤细胞减少，微血管生成减少。各组小鼠血液中的BUN、ALT、AST浓度均在正常范围内。HE染色未发现异常的心、肝、脾、肺、肾形态。结论：功能化氧化石墨烯是一种安全、有效的基因运载体，能够携带Stat3-特异siRNA表达质粒，显著抑制小鼠恶性黑色素瘤的生长。氧化石墨烯具有吸收红外线的物理学性质，联合红外线光照，与Stat3-特异siRNA表达质粒共同发挥抑制小鼠恶性黑色素瘤生长的作用。