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禽腺病毒血清4型（FAd V-4）是属于腺病毒科（Adenoviridea）腺病毒属（genus Aviadenovirus）的双链DNA无囊膜病毒,主要出现的临床特征为肝炎-心包积水综合征（HHS）。该病易感3～6周龄的肉鸡,导致80%的高死亡率。同时FAd V-4也可以在鸭鹅之间传播,间接证明FAd V-4感染对整个家禽业构成潜在的危险。由于FAd V-4的强传播、高致病及跨物种性,目前HHS已蔓延至世界各地给家禽养殖业造成了巨大的经济损失。SNXs家族分子在参与病毒复制以及调控天然免疫发挥重要的作用。然而,SNXs家族分子参与FAd V-4感染免疫调控的关联性以及作用机制尚未有报道。c GAS-STING通路介导的IFN-β产生的信号通路可以抵抗DNA病毒感染,ch STING是定位于内质网上的膜蛋白分子受到精细的双向调控,但该复杂过程受到哪些分子调控?分子机制如何?SNXs家族分子又是否可以参与FAd V-4感染激活c GAS-STING通路的调控?目前尚未有人研究。因此,本研究针对SNXs家族分子与FAd V-4感染调控c GAS-STING通路间的作用机制开展研究,主要研究内容与结果如下:1.FAd V-4感染LMH细胞TMT蛋白质组定量表达谱分析为探究FAd V-4感染过程中激活的天然免疫通路以及SNX9表达变化,本研究选择FAd V-4感染LMH细胞后的12h和24h时间点以及未感染的细胞进行TMT定量蛋白质组学分析。结果显示,总共产生了479648个光谱,67277个鉴定肽和16728个蛋白质。在B1/A组,发现了520个显著的DEPs,包括171个上调的DEPs和349个下调的DEPs。在B2/A组,共鉴定出1257个显著的DEPs,包括425个上调的DEPs和832个下调的DEPs。随后用GO、KEGG、COG、Pfam和亚细胞定位等方式对差异蛋白进行了功能注释和富集分析。GO和KEGG富集分析显示宿主细胞表达差异蛋白相关的途径均涉及先天免疫系统胞质DNA识别通路（Cytosolic DNA-sensing pathway）,可能包括c GAS-STING通路。同时通过RT-q PCR验证蛋白组数据的可靠性,结果发现PACSIN2、USPL1、ATXN10、ZNF507及SNX9显著上调。本章节揭示了胞质DNA识别通路c GASSTING以及SNX9在FAd V-4感染LMH细胞早中期可能发挥至关重要的调控作用。2.串联质谱筛选FAd V-4感染LMH细胞中ch STING潜在的调控互作蛋白—SNX9ch STING是c GAS-STING通路的关键衔接蛋白,为筛选FAd V-4感染时能够调控ch STING的关键蛋白。本研究通过免疫沉淀（IP）结合串联质谱鉴定的方法,筛选出272个可能与ch STING互作的蛋白。我们从中挑选出若干个可信度高的11个基因（HSPA8、G3BP1、DDX17、PRDX1、TBK1、HNRNPA2B1、DDX39B、HNRNPH3、NPM1、PABPC1、SNX9）进行克隆并构建真核质粒进行表达,探究该些基因对鸡IFN-β表达的影响,同时通过免疫共沉淀（Co-IP）和荧光共定位分析与ch STING蛋白的互作情况。利用双荧光素酶筛选测定结果显示这些基因能够调控STING介导的IFN-β的表达。其中7个蛋白（HNRNPA2B1、DDX39B、HNRNPH3、TBK1、NPM1、PABPC1、SNX9）能与ch STING发生互作,而仅仅SNX9和TBK1能够与STING发生细胞共定位。本章节明确筛选出FAd V-4感染时潜在调控ch STING的关键分子—ch SNX9。3.ch SNX9在FAd V-4感染调控IFN-β产生中的作用研究为探明ch SNX9在FAd V-4感染调控IFN-β产生中的作用,本研究利用大肠杆菌表达系统表达ch SNX9蛋白,并进行亚细胞定位分析。通过在LMH细胞中进行si RNA敲低和过表达ch SNX9分子,使用RT-q PCR测定FAd V-4感染LMH细胞的细胞因子IFN-β、IL-6,IL-1β及抗病毒蛋白Mx-1的变化。并使用IFA、Western-Blot及荧光定量检测FAd V-4的复制水平。结果显示ch SNX9蛋白呈现可溶性表达,定位在细胞质中。ch SNX9能负调控FAd V-4感染诱导LMH细胞IFN-β的产生,同时发现在病毒感染早期过表达能促进FAd V-4增殖,敲低ch SNX9的表达能够抑制其复制。本章节初步探究ch SNX9在FAd V-4感染调控天然免疫过程及其复制中的关键作用。4.ch SNX9介导c GAS-STING通路对FAd V-4感染的免疫调控作用机制为阐明在FAd V-4感染时ch SNX9调控c GAS-STING通路的作用机制。本研究通过分别将p Ds Red-Monomer-Golgi、p EGFP-Mito-Ds Red2和p Ds Red2-ER质粒和ch SNX9共转染LMH细胞来进一步研究ch SNX9在胞内内质网,高尔基体,线粒体定位细胞器定位情况。同时构建ch SNX9截短质粒,免疫共沉淀技术筛选其与STING互作的关键结构功能域。通过敲低STING和过表达SNX9验证SNX9是否通过与STING互作发挥功能作用。此外,在LMH细胞中分别过表达ch STING、ch TBK1以及ch SNX9,进行Co-IP实验来探究ch SNX9是否影响ch STING与ch TBK1之间的相互作用。结果显示ch SNX9定位于线粒体和高尔基体,ch SNX9的C端功能域（270-600aa）能与ch STING互作,充当调控中的关键作用。进一步发现ch SNX9能减弱STING和TBK1的结合从而负调控c GASSTING通路天然免疫。本章节进一步初步解析ch SNX9在FAd V-4感染时负调控c GAS-STING通路的分子机制,为FAd V-4防控提供一定基础。综上所述,本研究通过TMT定量蛋白组和串联质谱鉴定出潜在的调控c GAS-STING通路的关键分子ch SNX9,探明ch SNX9在FAd V-4感染诱导IFN-β的产生及病毒复制中的作用,明确ch SNX9可以减弱STING和TBK1的相互作用从而负调控天然免疫,为深入探究FAd V-4感染免疫调控机制奠定一定基础。