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目的:越来越多的研究发现肿瘤的发生与抑癌基因及癌基因的异常表达直接相关,如果抑癌基因突变或缺失失去活性,细胞就会在无控制状态下反复复制,最终形成肿瘤并发生转移。例如,抑癌基因SHP-1酪氨酸磷酸酶在造血细胞信号传导中发挥负调节作用,SHP-1表达的减少和缺失对肿瘤的发生起关键性作用。如果癌基因在白血病患者中失去了抑癌基因的负调控作用多数就会表现为异常高表达,如癌基因c-kit(为酪氨酸激酶受体家族Ⅲ类的一个重要成员),在多种白血病细胞中表达活跃。研究表明,启动子区的高甲基化导致了抑癌基因失活及癌基因表达活跃,因此恢复启动子区的正常甲基化有助于恢复基因的正常表达,从而达到基因治疗白血病的目的。本研究旨在探讨SHP-1及C-kit基因在急性白血病细胞中的表达情况及甲基化抑制剂As2O3和5-aza-CdR对SHP-1及C-kit表达的影响,为临床上去甲基化在白血病的预防和治疗中可能具有的重要作用提供实验室依据。
方法:通过细胞培养的方法对HL60细胞株进行传代培养,并用不同浓度的甲基化抑制剂5杂氮-2脱氧-胞苷(5-aza-2'-deoxycytidine,5-aza-CdR)和三氧化二砷(AS2O3)对其进行处理,用MTT法观察细胞药物抑制率;同时用RT-PCR方法检测对照组与实验组药物不同浓度,不同作用时间影响SHP-1、c-kit基因的mRNA的表达水平。
结果:
1.甲基化抑制剂5-aza-CdR和三氧化二砷对HL60细胞株的增殖均有明显的抑制作用,存在明显的剂量依赖性和时间依赖性;
2.RT-PCR显示,在原本不表达SHP-1mRNA的HL60细胞中,经过低、中、高三个不同浓度的AS2O3和(或)5-aza-CdR的处理后,SHP-1可以重新表达,而使原来高表达的c-kit mRNA的表达水平随之下降。当1.0μmol/l、2.5μmol/l、5.0μmol/l As2O3与0.5μmol/l、1.0μmol/l、2.0μmol/l5-aza-CdR单独分别作用于白血病细胞株时;随着浓度的升高,SHP-1mRNA的表达水平呈上升趋势,C-kit mRNA的表达水平呈下降趋势,经两两比较,有统计学意义(p＜0.05);
3.当1.0μmol/l、2.5μmol/l、5.0μmol/l AS2O3与0.5μmol/l、1.0μmol/l、2.0μmol/l5-aza-CdR单独分别作用于HL60细胞株时;细胞株均随着药物作用时间的延长,SHP-1mRNA的表达水平升高,C-kit mRNA的表达水平下降,24、48、72h作用下的表达水平经两两比较有差异(p＜0.05);
4.当两种药物联合应用在HL60细胞株时,As2O31.0μmol/l+5-aza-CdR0.5μmol/l、As2O32.5μmol/l+5-aza-CdR1.0μmol/l、As2O35.0μmol/l+5-aza-CdR2.0μmol/l SHP-1mRNA的表达水平比单独用药时显著升高,c-kit mRNA的表达水平比单独用药时降低,经比较有统计学意义(p＜0.05)。
结论:
1.HL60细胞株中SHP-1mRNA表达缺如,说明SHP-1与白血病发生有关;白血病形成中可能存在c-kit mRNA表达的异常增高;
2.5-aza-CdR和As2O3可增加HL60细胞株中SHP-1mRNA的表达,降低c-kit mRNA的表达。对于5-aza-CdR或AS2O3单独应用在该细胞上时,浓度越高,SHP-1平均表达水平越高,c-kitmRNA表达水平越低。在特定的一个浓度下,呈现时间的依赖性,5-aza-CdR和As2O3对SHP-1与c-kit的表达水平的影响呈剂量依赖性;
3.SHP-1mRNA与c-kitmRNA表达呈负相关,提示白血病细胞中SHP-1表达的降低或缺如消弱了对c-kit信号通路的负调控而在白血病形成中发挥作用;
4.两种药物联合应用有协同作用。作用机制我们考虑是发挥了去甲基化的作用,联合应用可加强去甲基化作用,为我们更有效的治疗血液肿瘤提供实验室依据.