秀丽隐杆线虫是一种无毒无害、可以独立生存的线虫，作为模式生物广泛应用于分子生物学和发育生物学的研究。CRISPR/Cas9基因敲除技术是近几年发展起来的一种来源于细菌获得性免疫系统的基因编辑技术，经过人工改造，目前已被广泛应用于多种模式生物的研究，是基因编辑领域目前很热门的研究工具。已报道大肠杆菌铁硫簇组装蛋白IscA的人同源蛋白ISCA1、ISCA2参与了细胞内[4Fe-4S]型铁硫簇的生物合成[1]，但具体的作用机制还不明确，且有文章报道参与细胞内[4Fe-4S]型铁硫簇生物合成的其中2个蛋白ISCA2和IBA57[2]的缺陷可导致新生儿脑白质发育不全，具体机制尚不明确。结合课题组前期研究，以秀丽线虫为模型探索 ISCA2蛋白在神经性疾病方面的功能，首先通过CB5600虫株观察线粒体形态，C.eIscA2蛋白低表后会出现线粒体形态异常，线粒体功能受损。然后通过神经特异性干扰虫株[3]敲低秀丽线虫体内铁硫簇组装蛋白C.eIscA2后，观察F1代线虫表型以及运动活力变化，发现神经特异干扰株KP3948线虫72h实验组F1代体型相较对照组变小，而野生型N2 72h实验组F1代体型相较对照组未变小。观察神经干扰株XE1375线虫神经元发育情况，可见实验组F1代各时期神经元发育受损，对照组神经元发育正常。这些现象都与文章报道的ISCA2蛋白缺陷导致神经特异性疾病相符合，但具体的原因及机制都不清楚[4]。为此，我们尝试更深入的探索ISCA2蛋白导致神经特异性疾病的机制，利用CRISPR/Cas9基因敲除技术实现线虫体内isca2片段敲除后获得突变体线虫，观察其后代线虫表型以及线虫线粒体功能变化，从而系统的分析ISCA2蛋白的功能。　　一.方法:　　1.运用RNAi技术敲低秀丽线虫体内铁硫簇组装蛋白C.eIscA2,对5种实现神经特异干扰的线虫喂饲RNAi，五种线虫是GABA能神经干扰虫株（XE1375）、多巴胺能神经干扰虫株（XE1474）、胆碱能神经干扰虫株（XE1581）、谷氨酰胺能神经干扰虫株（XE1582）、泛神经干扰虫株（KP3948）；神经特异干扰后观察F1代线虫表型及GABA神经元发育情况，干扰线虫拍照大小观察ImageJ测量大小统计，XE1375株线虫可在荧光显微镜下直接观察 GABA神经元[3]。　　2. C.eisca2：：GFP转基因线虫构建，将isca2基因包括上下游2000bp的完整序列连接到pDD95.77质粒，该质粒可以在线虫体内游离表达绿色荧光蛋白，连接后的完整质粒可在线虫体内表达C.eIscA2：：GFP融合蛋白，将构建好的质粒通过去内毒素抽提和标记marker质粒rol6按照1∶1的比例稀释成100ng/ul的浓度用于显微注射。将混合质粒注射入秀丽线虫性腺中，打散性腺后会被线虫吸收产卵传代后，观察f2代线虫中有roller表型的线虫，生物荧光显微镜下观察f2代线虫绿色荧光蛋白分布[9]。　　3.运用RNAi技术敲低CB5600线虫[6]体内铁硫簇组装蛋白C.eIscA2，利用体壁肌肉细胞线粒体融合有myo-3：：mito：：GFP的线虫CB5600，荧光显微镜下观察RNAi后线粒体形态改变。　　4.运用CRISPR/Cas9系统敲除秀丽线虫isca2基因。根据靶点设计原则，在isca2基因上下游各设计 3个靶点。构建包括cas9、sgrna1、sgrna2、的完整质粒，去内毒素处理抽提质粒后，和marker质粒表达mcherry蛋白的质粒pCFJ104按照1：1的比例稀释成100ng/ul的浓度用于显微注射[7]，单线虫 PCR检测isca2基因大小，筛选测序成功的突变株线虫。　　二.结果:　　1.敲低神经特异性干扰虫株体内铁硫簇组装蛋白C.eIscA2,神经特异干扰后观察F1代线虫表型及GABA神经元发育情况:L4期干扰线虫拍照大小直接观察并用ImageJ软件测量大小,统计发现神经特异干扰株KP3948线虫72h实验组F1代体型相较对照组变小，而野生型N2 72h实验组F1代体型相较对照组未变小；神经特异干扰线虫KP3948生长曲线实验组各时期体长低于对照组而野生型线虫生长曲线各时期体长和对照组基本持平；神经特异干扰线虫KP3948大小统计柱状图显示72h实验组体长小于对照组而野生型线虫72h实验组体长和对照组无差别，统计分析P值＜XE1375线虫神经元发育情况，可见实验组F1代各时期神经元发育受损，对照组神经元发育正常。这些结果符合文章报道ISCA2蛋白缺陷导致神经特异性疾病。　　2.转基因现虫C.eIscA2：：GFP构建成功，荧光显微镜下观察C.eIscA2蛋白定位初步显示为肠道，还需具体分析。　　3. RNAi技术敲低 CB5600线虫[6]体内铁硫簇组装蛋白C.eIscA2，观察RNAi后线粒体形态改变:观察到isca2-RNAi、对照组线粒体形态随着时间会有改变，isca2干扰组线虫随着时间线粒体先是细长结构、形态清晰，到96h后形态开始变化，144h后开始融合，264h融合非常明显，对照组线虫随着时间线粒体一直是细长结构、形态清晰、排列整齐。说明C.eIscA2蛋白低表后，线粒体形态异常，这些可能会导致线粒体的功能异常，对生命活动造成影响。　　4. CRISPR/Cas9基因敲除技术探索ISCA2蛋白的功能:运用CRISPR/Cas9系统敲除秀丽线虫isca2基因，基于敲除的突变率不高，且Cas9蛋白切割DNA后突变是随机发生的，所以isca2的突变类型也是多种多样，删除和插入的碱基数目不可预测，注射几对不同sgrna后，可发生单靶点突变，也可发生多靶点突变，从而发生大片段的删除。对于敲除筛选的F1代线虫中存在的嵌合体，通过交配策略获得纯合突变体，CRISPR/Cas9基因敲除系统具有很高的突变遗传概率，F1代与野生型交配的子代与子代交配得到 F2代即为纯合突变体[8]。通过直接检测单线虫 PCR扩增突变株线虫的isca2基因通过电泳条带大小初步判断敲除成功与否，进一步通过核酸测序根据结果分析isca2删除碱基情况。目前已成功构建包括cas9、sgrna1、sgrna2的完整质粒，并进行显微注射，还未筛选到测序成功的突变株线虫。