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蓝藻是一类能进行光合放氧的原核生物,具有结构简单、适应性强、分布广泛、便于外源基因转化和营养丰富等特点。随着基因工程的发展和蓝藻分子生物学研究的深入,人们通过重组DNA分子技术在蓝藻中构建了一系列新的表达载体,并成功表达了蓝藻基因工程下游产物。相对于其它基因工程受体系统,蓝藻细胞不仅无毒且有些种类还具有很高的营养价值,使得蓝藻成为一种独特的基因工程受体系统。自1984年适用于接合转移的可在大肠杆菌-蓝藻间穿梭表达的pRL载体构建完成至今,杀蚊幼虫毒素蛋白、人体超氧化歧化酶等一大批外源基因已在蓝藻中成功表达。然而,利用蓝藻基因工程制备重组药物的产业化进程并不顺利,究其原因,外源重组蛋白表达效率低下可能是关键因素之一。
集胞藻6803(Synechocystis sp.PCC6803)为单细胞原核藻类,培养条件简单,可光合自养,在特殊培养条件下也能进行异养生长,其基因组结构简单,序列也已于1996年测定完成,是蓝藻分子生物学研究的模式生物之一,具有天然的外源DNA转化系统;其细胞体积较大,对外源蛋白的容受力较高;有些藻类含有丰富的营养成分,为将来基因工程产物的直接食用提供了可能。
本研究首先利用本实验室已经构建好的转基因藻株Pg和Pg-s,运用蛋白免疫印迹检测转基因藻中外源基因的表达水平。明确异源groESL启动子的最佳诱导条件。实验结果表明:当藻细胞生长在衰退期时,经过42℃诱导0.5h,外源eGFP的表达量达到最高;通过转基因Pg和Pg-s藻株中外源基因表达水平的比较,发现SD序列能显著提高外源基因的表达量。
其次,本研究依据基因芯片数据,以高光诱导条件下转录水平上调的ndhK基因为目的基因,对其启动子序列进行预测。并把该启动子序列插入到同源重组载体P0上,转化集胞藻6803,得到含ndhK基因启动子片段的转基因藻株P330藻株。通过蛋白免疫印迹,研究不同生长时期、不同高光诱导时间以及二氧化碳浓度下转基因株系中外源基因的表达情况。结果表明,该未知启动子在高光诱导4小时,低二氧化碳培养条件下,使外源egfp基因的表达水平达到最高。比较Pg-s和P330两种不同诱导因子对eGFP的表达水平,经过Western Blot分析表明,P330修饰后的外源基因表达量比PgroESL加SD序列修饰的外源基因表达量的作用更加明显。
本研究分析了集胞藻6803中groESL启动子和SD序列以及新的调控元件P330对外源基因表达作用的特性。结果表明,经过这些调控元件都很大程度的提高了外源基因的表达。这为以后利用蓝藻制备药用基因带来了很大的市场应用的理论基础。