论文部分内容阅读
在对作物进行抗性改良、产量提高和品质改进时,需要将外源基因转入到特定的作物体内,这些外源基因需要在相应的启动子序列调控下进行表达。由于目前用于遗传改良的植物启动子数量有限,本研究以拟南芥β-葡萄糖苷酶19(Beta-glucosidase,BGLU19)基因启动子为研究对象对其进行活性分析,以期获得适宜作物遗传改良的启动子,满足植物基因工程的需要。 本研究首先对AtBGLU19启动子的序列结构进行分析,预测其中的组织特异性元件和胁迫应答元件。并通过设计特异引物克隆AtBGLU19启动子,构建植物表达载体,利用花序侵染法转化拟南芥并筛选获得转基因纯合植株。最后通过GUS组织化学染色对其活性进行了稳定表达分析,并利用农杆菌侵染烟草对其活性进行了瞬时表达分析。研究结果表明AtBGLU19启动子是一个种子特异性表达启动子,并且可以在异源植物中表达。总之,通过本研究为作物遗传改良提供了一个可供选择的种子高表达启动子,也为后续β-葡萄糖苷酶基因功能研究、基因工程改造植物β-葡萄糖苷酶基因从而获得生产用β-葡萄糖苷酶打下良好的基础。本论文的主要实验结果如下: 1.利用生物信息学方法筛选获得种子特异性表达基因。利用AtGenExpress Visualization Tool和Genevisible Expression Data等在线网站对TAIR网站拟南芥基因表达谱数据进行分析比较,发现AtBGLU19基因在种子中表达量非常高,是一个种子特异性表达基因,因此推测AtBGLU19启动子可能是种子特异性表达启动子。 2.通过手动检索和在线软件PLACE、PlantCARE对AtBGLU19启动子序列进行分析,鉴定出很多与组织特异性表达和胁迫应答相关的顺式作用元件。其中有作用明确且具相关性的三个种子特异性表达调控元件:GCN4元件(TGAGTCA)、AACA元件(AACAAAA)和ACGT元件(GTACGT);以及响应低温、ABA和干旱胁迫的顺式作用元件:四个ABA响应元件ABRE(ACGTACA、CGTACGTGCA和GACACGTGGC)、两个与冷胁迫有关的as-1元件(TGACG)和ACGTCA元件、一个MBS干旱应答元件(TAACTG)。 3.通过设计特异引物扩增AtBGLU19启动子序列。经过PCR扩增后,获得的目的条带回收纯化,通过酶切克隆至表达载体。酶切及测序结果表明成功构建了pBGLU19-GUS植物表达载体。 4.通过农杆菌介导的花序侵染法来获得转基因拟南芥植株,通过PCR扩增和抗生素进行筛选获得转基因拟南芥纯合株系,对纯系植株的种子、叶片、花、荚果等进行GUS染色实验,结果表明AtBGLU19基因启动子在种子中的表达量最高,AtBGLU19启动子是种子特异性表达启动子。 5.利用农杆菌侵染法将植物表达载体pBGLU19-GUS注射到烟草叶片,用瞬时表达的方法验证AtBGLU19基因启动子异源表达情况。GUS组织化学染色结果表明,转入pBGLU19-GUS质粒载体的烟草叶片被X-Gluc溶液染成蓝色,而野生型烟草叶片无染色,表明AtBGLU19基因启动子具有异源表达活性。 6.利用农杆菌介导的叶盘转化法成功获得转基因烟草。