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原发性肝癌是我国常见的恶性肿瘤之一,全世界每年新发的肝癌患者约45%发生在我国大陆地区,而且近年来发病率又有增高趋势,统计表明我国肝癌的年死亡率为20.40/10万,在城市和农村分别占恶性肿瘤死亡率的第一和第二位。现有的手术方法不能完全切除癌细胞;放、化疗等传统方法也不利于癌症的彻底治疗。随着肿瘤生物治疗技术的不断发展,基因治疗作为肝癌生物治疗的一个重要手段越来越受到重视。充分发挥机体的自身力量,如免疫功能治疗癌症是一条具有十分广阔前景的“绿色通道”。基因治疗在进入临床应用前必须解决组织和细胞特异性问题,以减少副作用。此外,由于肝癌细胞免疫原性弱,MHC分子、表面共刺激分子表达低下或缺乏,以及抑制自体肿瘤免疫等因素,现有的免疫治疗往往不能诱导有效的免疫应答,致使癌细胞能够逃避免疫系统的识别和攻击。超抗原无需抗原递呈细胞的加工,而是以完整的蛋白分子直接与抗原递呈细胞的MHC-II及T细胞受体(TCR)结合,从而激活大量的T细胞。金黄色葡萄球菌肠毒素A作为一种超抗原物质,应用于人类肿瘤治疗已有报道。CD80是一个重要的辅助刺激分子,通过与T细胞表面的CD28结合提供细胞活化所需的第二信号,刺激T细胞活化。在本研究中,我们以AFP启动子和增强子为调控元件、以共表达CD80和穿膜型葡萄球菌肠毒素A基因为目的基因,以Ad5腺病毒为载体构建了以AFP为肝癌靶向调控SEA/CD80共表达的重组腺病毒,为肝癌的免疫基因治疗的进一步实验奠定了基础。1.携带人AFP启动子和增强子序列的腺病毒穿梭质粒的构建目的:构建甲胎蛋白(AFP)启动子/增强子基因调控的腺病毒穿梭载体。方法:设计相关引物,利用实验室保存的人肝基因组DNA为模板,经PCR方法,获得AFP基因的启动子和增强子片段。利用本实验室之前改建好的pShuttle2穿梭载体,经连接、转化、提取质粒等步骤构建目的穿梭载体pShuttle-AFP。结果:经酶切鉴定和基因测序等方法鉴定,所克隆的AFP启动子和增强子序列与Genebank中公布的相关序列一致。酶切鉴定结果与预期结果一致。结论:我们成功构建了携带AFP启动子和增强子的腺病毒穿梭质粒pShuttle-AFP,为下一步肝癌特异性调控治疗基因的构建做好基础。2. AFP增强子和启动子调控的SEA-CD80共表达腺病毒穿梭质粒的构建目的:构建AFP增强子和启动子调控的SEA-CD80基因共表达穿梭腺病毒载体。方法:首先设计SEA和CD80目的片段的引物,分别以叶菁博士构建的pMD18-tmSEA载体和人肝cDNA为模板,经PCR方法获得穿膜型SEA(tmSEA)和CD80的目的基因片段;将tmSEA片段连接入pIRES2-EGFP载体,构建pIRES2-EGFP-SEA。利用免疫荧光方法检测穿膜型SEA的亚细胞定位。将CD80片段连接入pMD18-T载体,分别经连接、转化等步骤构建pMD18-T-CD80,构建完成的质粒经酶切鉴定正确的质粒送生物公司测序。将测序正确的pMD18-T-CD80质粒经双酶切,取得CD80目的片段。测序正确的pIRES2-EGFP-SEA质粒经双酶切,获得SEA-IRES片段与CD80克隆到pShuttle-AFP载体,构建目的载体pShuttle-AFP-SEA-CD80。结果:所克隆的SEA和CD80序列与Genebank中公布的相关序列一致。所有的酶切结果与预期结果一致。以构建好的穿梭质粒为模板,所有片段的引物为相关引物,PCR得到的结果与预期结果一致。同时,利用免疫荧光确定穿膜型SEA能够定位到细胞膜表面。结论:我们成功构建了以AFP基因为靶向调控的SEA-CD80基因共表达真核腺病毒载体。3.肝癌靶向SEA-CD80共表达重组腺病毒的构建目的:构建AFP基因调控的SEA-CD80基因共表达重组腺病毒。方法:采用AdEasyTM腺病毒制备系统将实验二中构建的穿梭载体pShuttle-AFP-SEA-CD80经Pme I单酶切线性化后,与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1共转化E. coli BJ5183。构建pAd-AFP-SEA-CD80重组腺病毒质粒。采用Pac I线性化pAd-AFP-SEA-CD80,转染AD293包装细胞,获得由AFP增强子和启动子调控的共表达SEA和CD80的重组腺病毒,并扩增。将腺病毒感染表达AFP的HepG2细胞,利用Western blot检测目的基因的表达。结果:所构建的pAd-AFP-SEA-CD80重组腺病毒载体,经Pac I酶切鉴定获得大小为3.5kDa和4.5kDa的预期目的片段,以重组载体为模板,所有片段的引物为相关引物,PCR得到的结果与预期结果一致。该腺病毒感染肝细胞癌HepG2后,能够特异性地检测到目的基因tmSEA和CD80的表达。结论:我们成功构建了以AFP启动子/增强子为靶向调控的SEA-CD80基因共表达重组腺病毒载体,并能够在HepG2细胞中特异性地表达目的基因tmSEA和CD80。为肝癌特异性调控免疫基因治疗剂的制备奠定基础。本研究成功的从人肝基因组DNA中克隆到人甲胎蛋白(AFP)的启动子和增强子序列,成功构建了AFP启动子顺式调控序列调控的腺病毒穿梭质粒pShuttle-AFP;成功地构建了穿膜型SEA,克隆了CD80基因,并将二者克隆到构建的pShuttle-AFP ,成功构建了pShuttle-AFP-SEA-CD80穿梭质粒;采用AdEasyTM腺病毒制备系统将构建好的pShuttle-AFP-SEA-CD80穿梭载体,与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1进行重组,构建pAd-AFP-SEA-CD80重组腺病毒载体。利用包装细胞,制备了AFP启动子调控的共表达穿膜型SEA和CD80分子的腺病毒,并能够在表达AFP的HepG2细胞中特异性地表达。本研究为肝癌靶向免疫基因治疗剂的制备提供了基础。