研究背景和目的长期糖尿病可以导致器官及组织的纤维化,例如糖尿病心肌纤维化和糖尿病肾脏纤维化。过度纤维化可以破坏器官及组织的正常结构,最终引起脏器功能紊乱及衰竭。成纤维细胞可以分泌大量的细胞外基质,高糖环境下过度增殖及活化的成纤维细胞被认为是糖尿病器官及组织纤维化的罪魁祸首。近期研究发现有相当数量的成纤维细胞是由内皮细胞转化而来,我们将这种现象称之为内皮细胞向间充质细胞转化(Endothelial-to-mesenchymal transition, EndMT)。内皮细胞间充质化在糖尿病心肌病及糖尿病肾病的疾病进程中发挥重要作用。在糖尿病心肌病小鼠模型中,心肌中有15%到20%的成纤维细胞同时表达内皮细胞标志物CD31及成纤维细胞标志物FSP1,这一比例是正常小鼠的2-3倍。此外,在糖尿病肾病模型的肾组织中,这一比例比例高达30%到50%,是正常小鼠的5-6倍。因此如何有效的阻断高糖诱导的内皮细胞间充质化已成为治疗糖尿病心肌及肾脏纤维化的重要突破口。聚(ADP-核糖)聚合酶poly(ADP-ribose) polymerase, PARP是一种DNA修复酶,在调控细胞的生存、凋亡过程中发挥重要作用。正常情况下PARP-1的活性相对较低,然而在DNA损伤时PARP-1的活性迅速升高,催化相应受体蛋白的聚ADP核糖基化反应,进而参与DNA的修复。在病理状态下,多种炎症因子的刺激,例如活性氧簇(reactive oxygen species, ROS),肿瘤坏死因子α(TNFα)等,可导致DNA大量断裂损伤,引起PARP-I过度激活,使细胞快速消耗NAD+,进而引起ATP的耗竭,最终造成细胞的功能失调及坏死。此外还有研究发现PARP-1的活化可以增加促纤维化炎症因子白介素1p(IL-1p)、肿瘤坏死因子a(TNFa)以及内皮素1(endothelin-1)的表达。近期Kessler等研究发现TGF-1、IL-1、TNFα的联合干预可诱导人肠道微循环内皮细胞内皮间充质转化。Widyantoro等亦证实内皮素1基因敲除可以抑制高糖诱导的内皮间充质化,然而作为这些促纤维化因子的上游调控基因PARP-1与内皮间充质化的关系尚未有人研究。Glucagon-like peptide-1 (GLP-1)是由肠L细胞产生的肠促胰岛素分泌肽。越来越多的研究发现GLP-的1受体不仅表达于胰腺组织,还表达于内皮细胞、平滑肌细胞以及心肌细胞上。新近研究显示GLP-1激动剂可以显著改善高脂诱导的心功能障碍及心肌纤维化。在我们前期研究亦发现,GLP-1能够通过抑制PARP-1/iNOS/NO途径改善氧化低密度脂蛋白诱导的胰岛微循环内皮损伤。因此上述研究表明GLP-1具有强大的心血管保护效应。但是GLP-1能否通过抑制内皮间充质化来改善糖尿病心肌纤维化尚无人报道。综上所述,我们围绕GLP-1与内皮细胞间充质化的关系及其潜在机制展开研究。本研究的研究目的为以下几点：1.GLP-1能否在体内及体外水平改善高糖诱导的内皮细胞间充质化。2.GLP-1抑制高糖诱导的内皮细胞间充质化的相关分子机制。研究方法1.细胞培养及分组：人主动脉内皮细胞分为72小时正常浓度葡萄糖(5mmol/1)干预组、72小时高糖(3Ommol/1)干预组、72小时高糖+PARP-1小干扰RNA组、72小时高糖+Snail小干扰RNA组、72小时高糖+GLP-1类似物组。2.动物饲养及分组：8周龄的C57BL/6小鼠经相应处理后分为以下三组：1.正常对照组；2.STZ诱导的1型糖尿病鼠；3.STZ诱导的1型糖尿病鼠+GLP-1 (24nmol/kg/day)受体激动剂组。3.心功能检测：小鼠干预结束后,应用经胸壁超声心动图技术检测心功能相应指标。4.ROS检测：将细胞种植在6孔板内,干预3天后,用DCFH-DA孵育。孵育0.5h后,用激光共聚焦显微镜拍照。之后通过分析荧光的相对强度来评估细胞内ROS的水平。5.Masson三色染色法检测心肌纤维化：将甲醛固定的心肌组织,切片,脱蜡至水,用Masson复合染色液5分钟,0.2%醋酸水溶液稍洗,然后用5%磷钨酸浸润5-10分钟,再用0.2%醋酸水溶液浸洗2次,Devil亮绿染色液5分钟,0.2%醋酸水溶液洗2次,无水乙醇脱水,二甲苯透明,中性树胶封片。6.免疫荧光技术观察体内及体外水平内皮细胞间充质化细胞及动物干预结束后,将相应的细胞及组织固定于4%多聚甲醛中,用0.03% Triton X-100穿透细胞膜,之后用10%山羊血清封闭,一抗湿盒4℃冷库中过夜,之后加入二抗。用激光共聚焦显微镜观察内皮细胞及成纤维细胞标记物的分布及表达。7.Westernblot细胞干预后,裂解细胞并离心,提取离心后的上清蛋白。上样之后,依次进行跑胶,5%牛奶封闭,一抗4℃冷库摇床过夜孵育,加入二抗孵育过后,依次加入显影剂、定影剂进行显影定影。8.明胶酶谱先将预处理后的细胞上清液于含0.1%明胶的SDS-聚丙烯酰胺行电泳分离,之后将凝胶置于含有二价金属离子的缓冲液中孵育,使样品中的MMP-2和MMP-9恢复酶活性,使其在相应位置水解凝胶中所含有的明胶成分。之后用考马斯亮蓝染色凝胶,之后再脱色。在蓝色的背景下,被水解明胶的部分可呈现出白色条带。最后与上清蛋白浓度校正后得出最终结果。9.统计学分析每数据均应用均数±标准差(Mean±SD)来表示,采用SPSS12.0软件行统计学分析。每组实验均重复3次以上。采用Pearson双变量相关分析来分析剂量依赖性的实验数据。对于多个组之间的比较,采用ANOVA检验,对于两两的比较应用Tukeys’t检验。认定P<0.05具有显著的统计学性差异。研究结果1.GLP-1治疗显著改善了STZ诱导的1型糖尿病鼠的心肌纤维化及心功能障碍小鼠超声心动图显示,相对于正常小鼠,糖尿病小鼠心功能指标出现明显恶化,GLP-1类似物治疗后,心功能得到显著改善。此外Masson三色及Westernblot显示,与正常小鼠比较而言,糖尿病小鼠心肌纤维化及细胞外基质明显增加,GLP-1类似物治疗组心肌纤维化程度显著降低。2.GLP-1分别在体内及体外水平抑制了高糖诱导的内皮细胞间充质化免疫荧光结果显示糖尿病小鼠心肌组织中成纤维细胞及内皮源性成纤维细胞比例显著高于正常。糖尿病小鼠经过GLP-1类似物治疗后,成纤维细胞及内皮源性成纤维细胞比例显著降低。在体外细胞培养实验中,72h高糖处理过的人主动脉内皮细胞在形态学上开始向成纤维细胞转化,即由典型的圆形变为梭形,同时伴随着内皮细胞标志物VE-cadherin的缺失及肌成纤维细胞标志物aSMA表达增加。3.GLP-1通过抑制ROS的产生抑制PARP-1的活化Westernblot显示,GLP-1可以明显抑制高糖引起人主动脉内皮中PARP-1的活化。此外我们应用免疫荧光技术证实,GLP-1可以显著降低高糖诱导过度生成的ROS。4.GLP-1通过抑制的PARP-1的活化降低高糖诱导的内皮细胞的间充质化我们应用PARP-1小干扰RNA预处理细胞,然后在高糖环境下培养72h。我们应用免疫荧光及Westernblot技术发现72h高糖培养可以促进PARP-1的活化、Snail的表达以及PARP-1与Snail(内皮间充质化的关键调控因子)在细胞核内共定位,PARP-1小干扰RNA处理后,高糖引起的上述变化得到显著抑制。更为重要的是,PARP-1小干扰RNA处理彻底抑制了高糖诱导的内皮间充质化。与此同时我们发现GLP-1可以显著降低PARP-1与Snail的表达及共定位。5.GLP-1可以通过抑制内皮细胞问充质化下调的Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白生成以及基质金属蛋白酶2、9的活性我们分别应用Westernblot和明胶酶谱技术发现,高糖可以明显促进Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白的生成以及基质金属蛋白酶2、基质金属蛋白酶9的活性。而PARP-1小干扰RNA,Snail小干扰RNA和GLP-1可以显著逆转这一现象。6.GLP-1可以抑制高糖引起的内皮迁移能力的增加我们应用划痕实验证实,高糖可以引起内皮细胞迁移能力的增加。免疫荧光技术显示迁移能力增加的细胞主要是间充细胞质化的内皮细胞。GLP-1及PARP-1、干扰RNA可已显著降低高糖引起的高迁移能力。研究结论1.GLP-1可以显著改善糖尿病心肌纤维化和心功能障碍。2.GLP-1可以在体内及体外水平显著逆转高糖诱导的内皮细胞间充质化。3.GLP-1下调高糖诱导的内皮细胞间充质化可能与抑制PARP-1的活化有关。研究意义高糖可以引起内皮细胞的间充质化,进而促进心肌组织纤维化,导致心功能.恶化。GLP-1受体类似物可以通过下调PARP-1的活性显著逆转高糖诱导的内皮间充质化,进而改善心肌纤维化及心功能。因此我们的研究为未来糖尿病器官纤维化的治疗提供了新的思路及理论支持。研究背景和目的胰岛素经内皮向骨骼肌间隙的转运是影响骨骼肌对葡萄糖摄取的“限速步骤”。有研究证实,增加骨骼肌微循环再灌注(microvascular recruitment),可以增大肌肉毛细血管床交换面积,进而促进胰岛素经内皮向骨骼肌间隙转运,最终增加骨骼肌对葡萄糖的利用。在胰岛素抵抗环境下(如肥胖,2型糖尿病等),胰岛素介导的骨骼肌微循环再灌注出现严重障碍,这一障碍限制了胰岛素经内皮向骨骼肌间隙转运,最终加重外周胰岛素抵抗。因此骨骼肌微循环系统己成为治疗胰岛素抵抗的新作用靶点。肾素-血管紧张素系统(renin-angiotensin system, RAS)是人体内重要的体液调节系统。该系统在维持身体人体血压及电解质平衡方面发挥极为重要的作用。血管紧张素Ⅱ (Angiotensin Ⅱ, Ang ⅠI)是该系统中重要的组成部分,该因子可以通过结合2种G蛋白偶联受体(血管紧张素1型受体(Angiotesin type 1 receptor,AT1R)和血管紧张素2型受体(Angiotesin type 2 receptor,AT2R))发挥相应的血管效应。例如在阻力血管(Resistance vessels)中,AngⅡ与AT1R相结合可以引起阻力血管的收缩以及平滑肌的增殖,AngⅡ与AT2R相结合则可通过激活下游的缓激肽/一氧化氮(bradykinin/NO)通路引起阻力血管的舒张进而对抗1型受体介导的缩血管作用。目前大多数研究主要集中在AngⅡ对大血管的调节作用,其对微循环系统的调节及其机制尚不清楚。早些时候Nora等研究发现,在骨骼肌微循环系统上普遍存在着血管紧张素1型及2型受体。此外,我们的前期研究发现,持续小剂量(1ng/kg/min)静脉输注血管紧张素Ⅱ可以在不引起血压变化前提下增加骨骼肌微循环再灌注。上述研究结果充分说明血管紧张素Ⅱ在调节骨骼肌微循环再灌注过程中发挥重要作用。Compound 21是近年来新开发的一种高选择非肽类血管紧张素2型受体激动剂,既往研究证实,持续静脉输注Compound 21并不能降低正常SD大鼠的平均动脉血压,只有在与血管紧张素II 1型受体阻滞剂联合应用时才能发挥其降压效应。近期研究发现,持续静脉输注Compound 21虽然未影响血压的变化,却可以明显增加局部组织(如肾动脉)的血流,且增加的幅度与性别密切相关。因此结合上述研究结果,我们提出假设应用Compound 21可以在不改变血压的前提下增加骨骼肌微循环再灌注。目前关于Compound21血管效应机制方面存在较大争议。Bonsnyak等在体外血管环实验(Myograph)中发现Compound21可以通过AT2R/NO通路发挥舒张血管的作用,与之相类似的是,Brouwers等在动物体内证实Compound21可以通过AT2R/NO途径舒张肾动脉,增加肾脏血流。但是近期erdonk等发现,Compound 21确实可以在体外水平引起微血管及大血管舒张,但这一作用并非依赖于AT2R/NO途径,而是通过直接抑制平滑肌钙离子内流直接实现的。更为有趣的是,Shao等研究报到Compound21可以通过直接作用于胰岛B细胞AT2R受体增加胰岛素的分泌,我们知道胰岛素可以通过NO途径增加骨骼肌微循环再灌注,因此Compound 21介导的体内舒血管效应是否与胰岛素的分泌增加有关亦值得探讨。综上所述,我们围绕Compound 21能否扩张骨骼肌微循环进及其潜在机制展开研究,本研究的研究目的为以下几点：1. Compound 21能否增加骨骼肌微循环再灌注。2. Compound 21是否通过AT2R/NO途径增加骨骼肌微循环再灌注。研究方法：1.动物饲养及分组将体重220-350g的成年雄性SD大鼠,置于22±2℃无菌饲养室喂养,饥饿过夜后用于实验。大鼠分为以下4组：1.盐水对照组；2.Compound21(300ng/kg/min)持续静脉注射组；3.Compound21加AT2R拮抗剂PD123319(50μg/kg/min); 4. Compound21加一氧化氮合酶抑制剂L-NAME(50μg/kg/min)组。2.麻醉及手术Inactin于腹腔内注射麻醉,之后将大鼠取仰卧位置放于操作台上,将加热垫置于其背部,以保证在整个实验过程中大鼠的体温在生理范围内。于颈部行正中切口,用镊子钝性分离肌肉和筋膜,然后暴露气管,切开气管并插入通气导管。分离两侧颈外静脉及颈动脉,置入导管。颈动脉插管连接到动态血压监测器上。左侧颈外静脉的插管用于之后实验的相应药物输入,右颈外静脉插管用于实验过程中超声造微球造影剂的输入。手术完成后,等待60分钟,以保证大鼠麻醉状态的稳定。3.动态监测骨骼肌间隙氧分压应用光导纤维氧检测系统动态监测骨骼肌间隙的氧分压。将氧分压感受器的针头插入大鼠右大腿内收肌及半膜肌的肌间隙中,之后轻轻推出带有氧敏感探头的玻璃纤维,使其轻轻进入到肌间隙中,稳定30分钟。实验开始后每10秒钟记录1次氧分压的数值,每分钟取均值。4.对照增强超声(CEU)检测骨骼肌微循环灌注情况应用对照增强超声影像可以检测到骨骼肌的微循环容量(Microvascular Blood Volume,MBV)、微循环血流速度(Microvascular Flow Velocity,MFV)、织微循环的血流量(Microvascular Blood Flow, MBF)。5.细胞培养及分组大鼠原代主动脉内皮细胞分为以下8组干预30分钟：空白对照组、胰岛素(10nmol/1)处理组、Compound 2110-9mol/l处理组、Compound 2110-8mol/l处理组、Compound 2110-7mol/l处理组、Compound 2110’6mol/l处理组、Compound 2110-5mol/l处理组、Compound 2110-4mol/l处理组。6.Westernblot细胞干预后,提取上清蛋白,上样跑胶,牛奶封闭,一抗过夜孵育,二抗加入显影剂定影剂。7.离体血管环实验(Myograph)在体式显微镜下分离大鼠隐动脉远支(≤50μm),清除周围结缔组织及脂肪组织,将分离后的动脉切成2mm的小段,将剪好的2mm动脉段悬挂于含有6m1生理盐溶液缓冲液(Physiological salt solution buffer, PSS)Multi Myograph System装置上,持续向装置内给予95%02-5%CO2并维持装置温度在37℃左右。在去内皮实验中,用头发丝去除血管环的内皮细胞,并用1μmol/L乙酰胆碱验证内皮是否被彻底去除。实验开始后先用11μmol/L苯肾上腺素预收缩血管,然后先后加入不同浓度的Compound 21 (10-9mol/l、10-8mol/l、10-7mol/l、10-6mol/l、 10-5mol/l、10-4mol/l)观察其舒张血管的效应,选择舒张血管作用最明显的浓度用于后续实验。在后续实验中我们分别用PD123319 (10-4mol/l)、L-NAME (10-5mol/l)、洛沙坦钾(10-5Smol/1)预处理血管环30分钟,再加入Compound 21并观察其对血管环张力的影响。8.统计学分析所有实验数据应用均数±SEM来表示,采用SigmaStat3.1.1统计软件(Systat Software,Inc)进行统计学分析。对于多个组之间的比较,采用ANOVA检验,对于两两的比较应用Tukeys’t检验。以P<0.05为有显著性差异。研究结果：1.Compound 21增加呈浓度依赖性增加内皮细胞eNOS磷酸化我们应用浓度梯度的(10-9mol/l、10-8mol/l、10-7mol/l、10-6mol/l、10-5mol/l、 10-4mol/l) Compound 21及i1(?)sulin (10nmol/l)干预大鼠原代主动脉内皮30分钟,Westernblot结果显示C ompound21在10-6mol/1浓度,可以显著增加eNOS磷酸化。2.超生理剂量的Compound 21通过AT2R非内皮依赖途径舒张远端隐动脉环我们应用浓度梯度的(10-9mol/l、10-8mol/l、10-7mol/l、10-6mol/l、10-5mol/l、 10-4mol/l) Compound 21干预血管环,我们发现只有在10-4mol/l, Compound 21可以显著舒张血管,且这一作用是非内皮依赖的。在后续实验中我们发现PD123319可以显著抑制Compound 21的舒血管效应,而L-NAME及洛沙坦钾无明显作用。3.Compound 21在未影响血压的前提下增加骨骼肌微循环的再灌注及骨骼肌间隙氧分压。在体内动物实验中,我们应用对照增强超声技术观察骨(即微循环灌注情况。在整个实验过程中,与盐水对照组相比,Compound21处理组血压无明显差异,但是Compound21静脉输注可以明显增加骨骼肌微循环再灌注。此外我们还发现Compound21静脉输注可以显著增加骨骼肌间隙氧分压。4.Compound 21增加骨骼肌微循环灌注是通过于AT2R/NO途径实现的为进一步探讨Compound 21在体内增加骨骼肌微循环灌注的机制,我们在静脉输注Compound2130分钟前,分别输注AT2R拮抗剂(50μg/kg/min)PD123319或一氧化氮合酶抑制剂L-NAME(50μg/kg/min)。我们发现PD123319和L-NAME显著的抑制了Compound 21诱导增加的骨骼肌微循环再灌注及骨骼肌间隙氧分压。研究结论：1. Compound 21在未影响血压的前提下增加骨骼肌微循环的再灌注及骨骼肌间隙氧分压。2. Compound 21介导的骨骼肌微循环再灌注效应可能是通过AT2R/NO途径实现的。研究意义：应用Compound 21直接激活骨骼肌微循环系统的血管紧张素2型受体可以扩张骨骼肌微循环,进而开放更多毛细血管床,增大血液及组织间隙的交换面积。因此我们推测Compound21具有促进胰岛素向骨骼肌间隙转运,增加胰岛素敏感性的潜在价值。这一发现为胰岛素抵抗的治疗提供了新思路及理论支持。