随着能源消耗的迅速增加,人类面临着资源紧缺和环境恶化方面越来越严峻的挑战。通过将可再生木质纤维素类生物质转化为液体燃料和有用化学品,有助于实现人类社会的可持续发展,并带来巨大的经济和社会效益。然而,木质纤维素材料结构的组成复杂,严重限制了其高效转化和发展生物炼制。因此,开发高效的木质纤维素降解资源多年来一直受到研究者的关注。越来越多的研究显示,由于具有极强的环境适应性和丰富的生化多样性,细菌将在木质纤维素生物转化过程中扮演越来越重要的角色。但是,与真菌相比,细菌降解木质纤维素的研究起步较晚,现有的文献报道对细菌降解木质纤维素的理解还很不全面,其木质纤维素降解酶和降解途径仍有待发掘,迫切需要对其降解体系及机制开展研究。本文以前期分离出的一株具有高效降解木质纤维素能力的水稻内生细菌Pantoea ananatis Sd-1为研究对象,对其降解特性和相应的降解体系及作用机理开展了系统研究,并取得如下创新性研究成果:(1)系统研究了P.ananatis Sd-1降解水稻秸秆的特性。在以水稻秸秆为唯一碳源的培养基中,P.ananatis Sd-1在6天内可以使水稻秸秆的总重量及其纤维素、半纤维素和木质素组分的含量分别减少62.7%、75.2%、78.8%和35.6%,产生的还原糖量可达0.1586 mg/ml。在降解过程中P.ananatis Sd-1分泌的内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、木聚糖酶、木质素过氧化物酶和漆酶活性分别达到1.55U/ml、0.47 U/ml、25.29 U/ml、2.59 U/ml和0.61 U/ml。(2)测定和分析了P.ananatis Sd-1的全基因组序列,并建立其木质纤维素降解相关基因数据库。全基因组测序和生物信息学分析结果显示,P.ananatis Sd-1全基因组大小为4,927,500 bp,GC含量为53.34%,共有4548个编码序列,其中具有蛋白质编码功能的基因有4332个,65个tRNA编码基因,9个核糖体RNA操纵子。通过与碳水化合物(CAZy)数据库比对发现P.ananatis Sd-1基因组中含有154个编码CAZy的基因,其中包括59个糖苷水解酶(GHs)编码基因、25个碳水化合物酯酶(CEs)编码基因、2个多糖裂解酶(PLs)编码基因、9个辅助酶(AAs)编码基因和11个碳水化合物结合组件(CBMs)编码基因。其纤维素酶、半纤维素酶及部分木质素酶编码基因均包含在这些CAZy中。将P.ananatis Sd-1的CAZy基因与相同种属的其他P.ananatis细菌及已报道的木质素、纤维素降解细菌比较,发现p.ananatissd-1的cazy基因数量最多,其中尤以ces与aas的基因数目远高于相比较的其他细菌。此外,还发现大量与木质素降解相关基因,包括多铜氧化酶、过氧化氢酶、醌氧化还原酶和谷胱甘肽转移酶等编码基因。醌氧化还原酶基因、gmc家族氧化还原酶基因以及具有β-酯酶活性谷胱甘肽转移酶基因的存在分别表明芬顿化学途径和和β-芳基醚降解途径有可能存在于p.ananatissd-1降解木质纤维素过程中。(3)从转录水平、酶活性和蛋白质组学层次对p.ananatissd-1的木质纤维素降解酶系进行了解析。在以水稻秸秆为碳源的培养基中,p.ananatissd-1的木质纤维素降解酶基因表达量均显著高于其在以葡萄糖为碳源的培养基中的水平(至少p<0.05)。与之对应,水稻秸秆培养基中测定的内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、β-葡聚糖酶、木聚糖酶、木质素过氧化物酶和漆酶活性均高于葡萄糖培养基中的活性。采用nanolc-ms/ms技术分析了p.ananatissd-1的分泌蛋白质组,从水稻秸秆培养基和葡萄糖培养基中分别鉴定出了108个和52个蛋白质,其中与木质纤维素降解直接相关的蛋白质数目分别为15和3。由此可见,p.ananatissd-1中的木质纤维素降解相关酶,其活性是受底物所诱导调控。(4)分析并验证了p.ananatissd-1降解木质纤维素过程中存在依赖芬顿反应(fe2++h2o2+h+→fe3++?oh+h2o)的非酶氧化体系。p.ananatissd-1可以降解未预处理的水稻秸秆,其处理3天后,水稻秸秆及其纤维素、半纤维和木质素组分的降解率分别达到46.7%、43.1%、42.9%和37.9%。而在分别加入二甲基亚砜(dmso)、甘露醇、硫脲和乙醇等羟基自由基清除剂后,可显著降低水稻秸秆降解率(p<0.001),可见其降解途径是羟基自由基依赖型。通过热裂解-气质联用和红外光谱分析发现p.ananatissd-1与芬顿试剂处理后的水稻秸秆成分化学结构变化类似。进一步研究芬顿反应的两大要素,即fe3+还原活性和过氧化氢的产生,发现p.ananatissd-1在水稻秸秆培养基中生长时所产的fe3+还原活性显著高于其在葡萄糖培养基中的fe3+还原活性。气质联用仪分析结果显示p.ananatissd-1在水稻秸秆培养基中的代谢产物中,含酚羟基的芳香化合物的fe3+还原活性显著高于其分泌蛋白质的fe3+还原活性。同时,基因转录水平和酶活检测发现,p.ananatissd-1中与过氧化氢产生有关的gmc家族氧化还原酶基因表达量和酶活性,在水稻秸秆培养基中均高于葡萄糖培养基,在秸秆粉末培养基中检测出过氧化氢浓度却低于葡萄糖培养基。综合上述数据均证明非酶氧化体系即芬顿化学途径很可能存在于p.ananatissd-1的木质纤维素降解系统中。总之,P.ananatis Sd-1木质纤维素降解体系包含木质纤维素降解酶水解体系和依赖芬顿反应的非酶氧化体系两大类,其降解机理很可能是初期通过芬顿反应产生的羟基自由基氧化破坏木质纤维素的完整结构,随后其分泌的一系列木质纤维素降解酶类能进入内部与相应的底物接触作用,从而降解木质纤维素。本论文的研究结果为目前尚未明确的细菌木质纤维素降解机制的阐明提供了更充分的科学依据,具有重要的科学价值。同时,也为P.ananatis Sd-1应用于木质纤维素原料的生物质转化奠定了理论基础。