目的 WT1基因定位于11p13，首先在Wilms瘤中发现并克隆。WT1基因长约50Kb，编码分子量为52-54KD的转录调控蛋白。WT1蛋白具有激活和抑制双重功能。近年来，人们发现WT1基因在多种白血病中异常表达，表达水平与预后呈负相关，表达水平升高与复发相关，但它在白血病的发生发展中所起的作用仍未明确。 反义寡核苷酸技术是基因治疗的一种常用方法，它通过特异性封闭有害基因的表达，来达到治疗的目的。 本实验的目的是通过WT1反义寡核苷酸特异性封闭急性白血病细胞中WT1基因的表达，从而下调WT1蛋白的表达，观察细胞的变化，研究WT1基因在白血病发生发展中的作用，探讨WT1反义寡核苷酸在白血病反义治疗或骨髓净化中的作用。 实验材料 1．K562细胞系和急性白血病患者的细胞 2．WT1反义寡核苷酸链和正义寡核苷酸链 3．Western印迹的相关试剂 实验方法 1．急性白血病患者细胞中WT1蛋白表达的检测 1．1 骨髓单个核细胞的分离与培养 取骨髓2ml，肝素抗凝，PBS稀释3-4倍，缓慢加至Ficoll淋巴细胞分离液上，离心，取界面层单个核细胞（MNC），PBS洗涤2次。加入含10％小牛血清（FBS）、100IU／ml青霉素、100IU／ml链霉素的RPMI 1640培养液培养，剩余一滴细胞悬液滴片，用瑞氏—姬姆萨染色液染色，光镜下观察细胞形态，白血病细胞超过90％。细胞置于37℃、5％CO₂、饱和湿度的培养箱中常规传代培养。 1.2细胞中总蛋白的提取 取对数生长期细胞，加人RIPA裂解液，充分混匀后冰上裂解1小时，离心收集上清。提取的总蛋白用紫外分光光度法测定蛋白浓度。 1.3 Western印迹检测急性白血病细胞中WTI蛋白的表达 2.WTI反义寡核昔酸对急性白血病细胞的抑制 WTI蛋白阳性细胞分3组，AS组、SE组和空白对照组，分别加人等体积的反义寡核昔酸链、正义寡核昔酸链和1640培养液，寡核昔酸试剂的终浓度为200卜扩耐，以后每24小时追加一次，寡核昔酸试剂终浓度为100林g/d，连续培养%小时。培养条件:37℃、5%CO:、饱和湿度。 2.1细胞形态学检测 细胞用瑞氏一姬姆萨染色液染色，光镜下观察细胞形态。 2.2 Westem印迹检测反义寡核昔酸对Wl，1蛋白表达的影响。结果 1.Westem印迹检测9例急性白血病细胞中Wl，1蛋白的表达，6例阳性，其中AML（6/8），ALL（0/1）。 2.反义寡核昔酸处理急性白血病细胞后的结果: 2.1 AS组细胞出现核固缩、核碎裂，细胞的数量没有增多。而SE组和空白对照组细胞形态无明显变化，数量则明显增多。 2.2 Western印迹结果显示AS组WTI蛋白表达与SE组和空白对照组相比有明显下降。结论 WTI在急性白血病中表现为一种癌基因，Wl，1反义寡核昔酸能抑制急性白血病细胞中WTI蛋白的表达，抑制细胞的增殖，促进细胞死亡。W，rl反义寡核昔酸可能成为一种有效的反义制剂或骨髓体外净化的手段。