变铅青链霉菌的DNA异常修饰系统是一种不同于甲基化修饰的新型修饰系统，它可使变铅青链霉菌DNA在电泳时易遭到氧化双链切割（Dnd表型，DNA degradation）（Zhou et al.,1988）。现已初步揭示这是一种硫元素的修饰（Zhou et al.,1999）。本研究从分子水平上对这种异常修饰进行了研究，缩小定位了异常修饰基因簇，并进行了核苷酸序列测定和分析，同时通过基因置换等技术对异常修饰基因的功能以及基因簇表达调控进行了初步探索。 变钳青链霉菌突变株ZX1由于染色体发生人片段缺失而丧失这种异常修饰系统（Zhou et al.,1994b）。首先对这段缺失区域进行了研究。通过Southern杂交和亚克隆，精确定位和克隆了这段缺失区域的两个端点及缺失界点。两个端点分别定位在野生型菌株基因组文库粘粒16C3的4.3kb的BamH1-EcoR1片段上和17G7的1.2kb的SalⅠ片段上，缺失界点定位在ZX1染色体上的一个2.8kb BamHⅠ片段上。随后制作了这个缺失区域的BamH1酶谱。这项工作不仅为野生型菌株物理图谱的完善提供了必要的信息，证实了与Dnd有关的12kb的区域在ZX1染色体上的完全缺失，也为Dnd功能区的精确定位奠定了工作基础。 为了阐明变铅青链霉菌DNA异常修饰系统的遗传学基础，以这段与Dnd表型有关的12kb区域为基础，获得了不同长度、不同起止点的六个亚克隆pHZ1900～pHZ1905。将这些不同的亚克隆以整合形式导入Dnd表型缺失突变株ZX1中，根据互补能力的不同确定了这段12kb区域中Dnd功能必需区有8.3kb。将这个8.3kb的区域以整合形式导入无Dnd表型的两个异源宿（?）中，均使它们获得了Dnd表型，表明这段8.3kb的区域包含了完整的异常修饰的功能。 为了对Dnd功能区域进行序列测定和分析，通过ExoⅢ缺失实验，获得了38个单向渐减缺失亚克隆。序列测定和分析表明这个8.3kb的区域中含有三个成簇排列的基因dndA（1.1kb）、dndB（1.0kb）和dndC（3.2kb）。其中dndA是第一个早已被分离的异常修饰基因（Zhou et al.,1999）。同源性比较揭示dndA与同氮酶基因mifS高度同源，而dndB和dndC则在数据库中找不到明显同源的序列。为了保证序列的准确性，又从另一个方向制备了28个ExoⅢ单向渐减缺失亚克隆，以备对dnd基冈簇的另一条DNA链进行序列测定，以保证序列的准确无误。 展开了对dnd基因功能的初步研究。首先利用基因置换实验获得分别在dndB、dndC基因内部发生基因中断的突变菌株LA1利LA2，并通过Southern杂交进行了验证。这两个突变株均丧失了Dnd表型，暗示这些基因与变铅青链霉菌的异常修饰直接相关。构建了用于完整基因簇置换的结构pHZ1918利用于双基因置换的结构pHZ1912，以备筛选全基因簇置换突变菌株及双基因同时置换突变菌株。另外通过比较这几个突变株及野生型菌株在产孢和黑色素基因（mel）表达方面的差异，推测dndA及其下游区域与变铅青链霉菌的产孢和刺激外源黑色素基因的表达有关，而dndB和dndC则与之无关，因为LA1和LA2在这两种表型上与野生型菌株无明显差异。 在dnd基因簇调控方面进行了初步探索。当完整的dnd基因簇整合在ZX1染色体上或由1～2个拷贝的自主复制的质粒携带进入ZX1，都能在ZX1中检测到Dnd表型，但是由10个或超过10个拷贝的质粒携带进入ZX1，就检测不到Dnd表型。而在高拷贝质粒上的dnd基因似乎是 李爱英 变铅青链霉菌DNA异常修饰系统的分子生物学研究 能表达的，因为它能红补分别在dn剧、dndB和咖JC发生单个基因突变的菌株，而且这种表 达似乎也不会影响野生型菌株1326中原有的dnd基因簇的表达。推测所有的dnd基因若同时 超量表达可能会对宿主不利，Dnd蛋白的剂量不能超过宿主忍耐的限度，因而受到严格的控制， 另一方面，在宿主可以接受的而且表达平衡的剂量范围内，协调表达的Dnd蛋白会抑制dnd基 因簇进一步超量表达。这种自我调控的存在或许是因为其中的某个Dnd蛋白具有感应（sensor） ，!兀性。这种luJ一能的白我调控机制说明在野生型菌株中的这种异常硫修饰是受到严格调控的。另 外，这儿个Ond蛋白的表达可能是一种程序化的有序的表达，使得这三个蛋白（或其中两个） 不能同时超量表达。